VeriFi^® Polymerase は、より高い配列精度が必要とされるすべての PCR アプリケーション向けに設計された、汎用性が高く堅牢な高忠実度校正 DNA ポリメラーゼです。

VeriFi® Polymerase は、3′-5′ エキソヌクレアーゼ (校正) 活性のために Pfu DNA ポリメラーゼに由来します。この高忠実度酵素は、プロセッシビティを大幅に向上させる独自の変異で設計されており、その結果、伸長時間が短縮され (10-30 秒/kb)、収量が増加し、17.5 kb を超える真核生物ゲノム テンプレートを含む、より長く困難なターゲットを増幅できるようになります。

VeriFi^® Polymerase の高い精度と強化された 3′-5′ エキソヌクレアーゼ活性により、Taq DNA ポリメラーゼよりも約 100 倍高い忠実度が得られます。この酵素は、クローニング、部位特異的変異誘発、シーケンシングなど、より高い精度が求められる用途に最適です。この範囲の製品を使用して生成された PCR 産物は平滑末端です。

VeriFi^® Polymerase は、最小限の最適化を必要とせず、または最適化をまったく必要とせずに、幅広いターゲットおよびフラグメント サイズの高忠実度 PCR を可能にします。この酵素には、dNTP と Mg の両方を含む高度なバッファー システムが付属しています。GC リッチなシーケンスや複雑な二次構造を持つシーケンスなど、最も困難なテンプレートの場合、PCR パフォーマンスを向上させるために VeriMax Enhancer を反応ミックスに追加するオプションがあります。

VeriFi^® Polymerase は、プライマーとテンプレート以外のすべての反応成分を含む便利な 2x レディミックスとしてもご利用いただけます。当社の 2x red mix には、アガロースゲル電気泳動中の直接ローディングおよび追跡に適した赤色色素が含まれています。

VeriFi® Polymerase は、示された範囲のフラグメント長を高い収率と特異性で増幅します。開始テンプレート量は、マウスまたはヒトのゲノム DNA 4～30 ng で、1.5～3 倍に希釈されます。GC 含有量は 37～55% です。L: PCRBIO ラダー II。

HBB 遺伝子の 17.5 kb フラグメントの増幅。開始テンプレート量は、2 倍に希釈したヒトゲノム DNA 150 ng (A および C) および 30 ng (B および D) です。2 ステップ PCR プロトコルを使用し、増幅は 72°C (A および B) または 68 °C (C および D) で行いました。GC 含有量は 37% です。VeriFi® Polymerase は、Takara PrimeSTAR GXL DNA ポリメラーゼに匹敵する収量で長いフラグメントを増幅します。L: PCRBIO ラダー II。

マウスゲノム DNA の異なる開始テンプレート量を使用した GAPDH 遺伝子の 1.0 kb フラグメントの増幅。A: 20 ng、B: 3.2 ng、C: 0.5 ng、D: 0.08 ng。GC 含有量は 51% です。L: PCRBIO ラダー IV。反応は製造元の推奨事項に従って設定されました。サイクル条件は、95 °C 2 分、その後 98 °C 15 秒、66 °C 15 秒、72 °C 30 秒を 30 サイクルでした。VeriFi® Polymerase は、主要な競合製品と比較して、より高い感度と特異性を示します。

VeriFi Polymerase

VeriFi™ Mix

VeriFi™ Mix Red

アッセイに特殊なバッファーが必要な場合、VeriFi^® Polymerase を使用できますか？

VeriFi^® Polymerase に付属の 5x VeriFi バッファーは、この酵素専用に開発されたもので、併用することを強くお勧めします。ただし、VeriFi^® Polymerase は、Pfu ポリメラーゼ用に開発されたすべての PCR バッファーと互換性があります。VeriFi^® Polymerase でカスタマイズされたバッファーを使用する場合は、アニーリング温度や酵素、テンプレート、dNTP、MgCl₂ の濃度などの反応パラメータの最適化が必要になる場合があることに注意してください。

VeriFi^® Polymerase はコロニー PCR に使用できますか？

はい。細菌コロニーを使用する場合は、滅菌チップを使用してコロニーを選択し、50 µL の PCR 反応液に再懸濁します。液体培養から作業している場合は、最終混合物に 5 µL の一晩培養液を追加します。一般的なプロトコルに従い、最初の変性時間を 95 °C で 10 分に増やします。

VeriFi^® Polymerase はマルチプレックス PCR に使用できますか？

VeriFi^® Polymerase にはホット スタート テクノロジーは含まれていませんが、低温では本質的に活性が低く、ホット スタートを備えていない Taq ポリメラーゼと比較してはるかに低い活性です。これは、一部のマルチプレックス アプリケーションに使用できることを意味します。

初めてマルチプレックス PCR を実行するときは、55 °C ～ 65 °C のアニーリング温度勾配を実行することをお勧めします。最高の特異性が得られるアニーリング温度を、その後の実験で使用する必要があります。マルチプレックス PCR には高速サイクリング条件を使用しないでください。最初は 90 秒の延長時間を推奨しますが、収量を増やすためにこの時間を延長することもできます。

マルチプレックス反応の場合、反応は開始から終了まで氷または冷却ブロック上でセットアップする必要があります。プライマーは、末端検出法で簡単に分析できる多様なアンプリコン長を維持しながら、配列の重複を可能な限り回避するように慎重に設計する必要があります[1]～[3]。

1. Markoulatos, P., Siafakas, N. & Moncany, M. Multiplex polymerase chain reaction: a practical approach. J Clin Lab Anal 16, 47-51, doi:10.1002/jcla.2058 (2002).
2. Radhika, M., Saugata, M., Murali, H. S. & Batra, H. V. A novel multiplex PCR for the simultaneous detection of Salmonella enterica and Shigella species. Brazilian Journal of Microbiology 45, 667-676, doi:10.1590/s1517-83822014005000041 (2014).
3. Perez-Perez, F. J. & Hanson, N. D. Detection of plasmid-mediated AmpC beta-lactamase genes in clinical isolates by using multiplex PCR. J Clin Microbiol 40, 2153-2162, doi:10.1128/jcm.40.6.2153-2162.2002 (2002).

私の結果には、非特異的なアンプリコンまたはスメアのバックグラウンドが多く含まれています。トラブルシューティングについて何かアドバイスはありますか？

スメアが懸念される場合は、それが最適ではない条件でアガロースゲル電気泳動を実行したことによるアーティファクトではないことを確認することをお勧めします。最適ではない条件には、高電圧やゲルが固まるのに十分な時間を与えないことなどが含まれます[1]。

また、PCR 反応のトラブルシューティングが必要になる場合もあります。その場合は、以下の提案と文献[2]を検討してください。

• プライマーは、プライマー間の相互作用を防ぎ、特異性を向上させるように設計する必要があります
• アニーリング温度を上げるか、アニーリング温度勾配 PCR を実施して最適なアニーリング温度を決定します
• 反応中のテンプレートの量を減らします。高品質の DNA を得るには、50 μL 反応あたり 1 ～ 100 ng のゲノム DNA または 5 ng 以下のプラスミド/ラムダ DNA を使用します
• サイクル数を減らします
• 反応あたりの酵素量を減らします
• プライマー濃度を減らしますが、各プライマーの濃度が 100 nM 未満にならないようにします
• 最終濃度が 5% ～ 10% になるように反応液に DMSO を含めます

1. Koontz, L. Agarose Gel Electrophoresis. Laboratory methods in enzymology : DNA. First edition. edn, Vol. 529 35-45 (2013).
2. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp, e3998, doi:10.3791/3998 (2012).

私の結果では、収率が非常に低いことがわかりました。トラブルシューティングについて何かアドバイスはありますか？

以下の提案を検討し、文献[1]も参照するとよいでしょう。

• アニーリング温度勾配 PCR でアニーリング温度を最適化します
• 反応中のテンプレートの量を増やしてください
• サイクル数を増やします
• 反応あたりの酵素の量を増やします
• プライマー濃度を上げますが、各プライマーの濃度は 1 µM を超えないようにしてください
• 新しい dNTP ソリューションを試してください
• MgCl₂を最適化してください

1. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp, e3998, doi:10.3791/3998 (2012).

DNA の GC 含有量が高いため、PCR 産物の収量が低くなっています。この場合、VeriFi^® Polymerase の最適な変性温度と時間はどれくらいですか？

GC を多く含む DNA を扱っていて、PCR 産物の収量が低すぎる場合は、変性温度を 98 ～ 100 °C に上げてみてください。VeriFi^® Polymerase はこれらの温度に耐えることができ、95 °C での変性に比べて GC 含有量の多い DNA の収量が増えることがわかっています。変性時間は、必要に応じて 10 秒から 30 秒まで変更できます。

VeriFi^® Polymerase の異なるフォーマットの違いは何ですか？

VeriFi^® Polymerase は 2 つの形式で利用できます。1 つの形式には酵素 (2 ユニット/µL) と別の 5x VeriFi バッファーが含まれており、もう 1 つの形式には酵素とバッファーが 2x ミックスとしてあらかじめ混合された便利なものが含まれています。さらに、2x ミックスには赤色色素も用意されており、アガロースゲル電気泳動中の直接ローディングと追跡がさらに便利になります。当社のすべてのフォーマットには、プライマー、テンプレート、PCR グレードの水以外の PCR に必要な反応コンポーネントが含まれています。

アガロースゲル上での Red Mix 色素の見かけの Mw はどれくらいですか？

この非阻害性色素は、ゲルへの直接ローディングを可能にするために添加されており、1% アガロースゲルでは 200 ～ 300 bp、2% アガロースゲルでは 50 ～ 100 bp の DNA フラグメントと同様の速度で泳動します。異なるアガロース含有量のゲルを泳動すると、この見かけの分子量に変化が見られる場合があります。

PCRBIO HiFi Polymerase と VeriFi^® Polymerase の違いは何ですか？

VeriFi^® Polymerase は、PCRBIO HiFi Polymerase に比べて処理能力が強化されており、伸長時間が短く (10 ～ 30 秒/kb)、収量が高く、より長い (最大 17.5 kb) より困難なターゲットを増幅できます。また、VeriFi^® ポリメラーゼは、PCRBIO HiFi Polymerase よりも忠実度が高くなっています。PCRBIO HiFi Polymerase とは異なり、VeriFi^® Polymerase は、直接ゲルにロードするための赤色染料のオプションが付いた便利な 2x レディミックスとして提供されており、反応のセットアップと分析にかかる時間を節約できます。

野生型 Taq DNA ポリメラーゼと比較した VeriFi^® Polymerase の忠実度はどれくらいですか？

VeriFi^® Polymerase はエラー率が非常に低く、野生型 Taq DNA ポリメラーゼよりも約 100 倍高い忠実度を持っています。

VeriFi^® Polymerase の推奨延長時間はどれくらいですか？

真核生物 DNA からの増幅には、1 キロベース (kb) あたり 30 秒が推奨されます。ロードされるテンプレート DNA が多すぎない場合には、伸長時間を短縮することが可能です。増幅後に非特異的なバンドが存在する場合は、テンプレート DNA の量を減らす必要があります。アニーリングと伸長を組み合わせた 2 ステップのプロトコルも可能です。マニュアルで推奨されている条件と濃度から逸脱する場合は、サイクリング条件とテンプレート濃度の最適化が必要になる場合があります。

VeriFi^® Polymerase を使用して生成されたフラグメントでは、どのような種類のクローニング戦略を使用すればよいですか？

VeriFi^® Polymerase によって生成された PCR 産物は平滑末端を持っているため、さらなる修飾を必要とせずに平滑末端クローニングに適しています。

A オーバーハングを追加したい場合は、Taq DNA ポリメラーゼまたは Klenow (exo-) DNA を使用し、その後 TA クローニングを行うことができます[1]。Aオーバーハングの追加を進める前に、反応からVeriFi^® Polymerase が除去されていることを確認してください。VeriFi^® Polymerase が存在する場合、酵素の3’-5’エキソヌクレアーゼ活性によりAオーバーハングが除去されます。

1. Yao, S., Hart, D. J. & An, Y. Recent advances in universal TA cloning methods for use in function studies. Protein Eng Des Sel, doi:10.1093/protein/gzw047 (2016).

10x VeriMax Enhancer はいつ使用すればよいですか？

収率が低い場合、または増幅が観察されない場合は、10x VeriMax Enhancer を反応混合物に添加することをお勧めします。このエンハンサーは、GC リッチ テンプレートや複雑な二次構造を持つテンプレートなど、一部の難しいテンプレートや長いテンプレートでの VeriFi^® Polymerase のパフォーマンスを向上させることができます。