VeriFi^® Hot Start Polymerase は、高精度の PCR を実現する AptaLock™ ホット スタート テクノロジーを備えた、多用途で強力な校正酵素です。

VeriFi^® Hot Start Polymerase は、3’-5’ エキソヌクレアーゼ (校正) 活性を持つ Pfu DNA ポリメラーゼから派生した単一酵素です。独自の変異は、天然型と比較して DNA 結合を改善し、処理能力を高めます。その結果、伸長時間が短縮され、収量が増加し、より長くより困難な標的を増幅する能力が得られます。VeriFi^® Hot Start Polymerase は、17.5 kb を超える真核生物のゲノム テンプレートを増幅することができ、より単純な DNA テンプレートの場合はそれよりも長くなります。ほとんどのアプリケーションでは、1 kb あたり 30 秒の伸長時間が推奨されます。

野生型 Pfu 酵素の独自の修飾により、VeriFi^® Hot Start Polymerase の精度が向上し、極めて低いエラー率と、Taq DNA ポリメラーゼの約 100 倍高い忠実度が得られます。この新しい酵素は、クローニング、部位特異的変異誘発、シーケンシングなど、優れた精度が求められる用途に最適です。

VeriFi^® Hot Start Polymerase には、dNTP、Mg、エンハンサーなどの高度なバッファー システムが備わっており、GC や AT の含有量に関係なく、幅広いターゲットやフラグメント サイズの高忠実度 PCR が可能になります。GC リッチなシーケンスや複雑な二次構造を持つシーケンスなど、最も困難なテンプレートの場合、PCR パフォーマンスを向上させるために VeriMax Enhancer を反応ミックスに追加するオプションがあります。

VeriFi^® Hot Start Polymerase は、プライマーとテンプレート以外のすべての反応成分を含む便利な 2x レディミックスとしてもご利用いただけます。当社の 2x red mix には、アガロースゲル電気泳動中の直接ローディングおよび追跡に適した赤色色素が含まれています。

異なるアニーリング温度 (A: 63.0 °C、B: 61.5 °C、C: 60.5 °C) でのラムダファージゲノム (6 ターゲット) とマウスゲノム (4 ターゲット) を使用した 10 プレックス PCR。開始テンプレート量は、ラムダ DNA 1 pg とマウス gDNA 1 ng です。アンプリコンの長さは 139 bp から 962 bp です。反応は、製造元の推奨に従ってマスターミックス形式を使用してセットアップされました。サイクル条件は、95 °C 2 分、95 °C 15 秒の 40 サイクル、A から C へのアニーリング 30 秒、72 °C 90 秒でした。
L: PCRBIO ラダー III。P: 単一産物の参照プール。

VeriFi^® Hot Start Mix は、主要な競合製品と比較して、マルチプレックスにおいて優れた感度と特異性を発揮します。

PCRBIO HS VeriFi^® Mix を使用して、GC 含有量が 28.7% ～ 83% の 13 のターゲットを増幅しました。開始テンプレート量は 30 ng のマウス cDNA です。バンド サイズは 99 bp ～ 274 bp です。サイクル条件は、98 °C 5 分、98 °C 15 秒の 40 サイクル、54 °C ～ 62 °C (ターゲットによって異なります) で 15 秒、72 °C 30 秒のアニーリングでした。L: PCRBIO Ladder III。

異なるアニーリング温度（A：68.5 °C、B：66.0 °C、C：63.0 °C、D：60.5 °C）でのヒトβ-グロビン遺伝子の13.5 kb断片の増幅。開始テンプレート量は30 ngのヒトゲノムDNAです。GC含有量は37％です。反応はマスターミックスフォーマット（タカラのPrimeSTAR^® GXL DNAポリメラーゼ以外）を使用して、製造元の推奨事項に従ってセットアップされました。サイクル条件は、95 °C 2分、その後95 °C 15秒、アニーリング15秒、72 °C 12分を30サイクルでした。

VeriFi^® Hot Start Mix は、主要な競合製品と比較して、より高い収量と特異性を示します。PCRBIO ミックスは、アニーリング温度範囲全体にわたって、より高い一貫性と汎用性も示します。

VeriFi^® Hot Start Polymerase

VeriFi^® Hot Start Mix

VeriFi^® Hot Start Mix Red

アッセイに特殊なバッファーが必要な場合、VeriFi^® Hot Start Polymerase を使用できますか？

VeriFi^® Hot Start Polymerase に付属の 5x VeriFi バッファーは、この酵素専用に開発されたもので、併用することを強くお勧めします。ただし、VeriFi^® Hot Start Polymerase は、Pfu ポリメラーゼ用に開発されたすべての PCR バッファーと互換性があります。VeriFi^® Hot Start Polymerase でカスタマイズされたバッファーを使用する場合は、アニーリング温度や酵素、テンプレート、dNTP、MgCl₂ の濃度などの反応パラメータの最適化が必要になる場合があることに注意してください。

VeriFi^® Hot Start Polymerase はコロニー PCR に使用できますか？

はい。細菌コロニーを使用する場合は、滅菌チップを使用してコロニーを選択し、50 µL の PCR 反応液に再懸濁します。液体培養から作業している場合は、最終混合物に 5 µL の一晩培養液を追加します。一般的なプロトコルに従い、最初の変性時間を 95 °C で 10 分に増やします。

VeriFi^® Hot Start Polymerase はマルチプレックス PCR に使用できますか？

VeriFi^® Hot Start Polymerase には革新的な AptaLock™ テクノロジーが採用されており、室温での望ましくない反応を最小限に抑え、この製品をマルチプレックス化に適したものにしています。

初めてマルチプレックス PCR を実行するときは、55 °C ～ 65 °C のアニーリング温度勾配を実行することをお勧めします。最高の特異性が得られるアニーリング温度を、その後の実験で使用する必要があります。

マルチプレックス反応の最適な延長時間は、テンプレートの複雑さ、アンプリコンの長さ、ターゲットの数によって異なります。最も長いフラグメントの伸長時間から始めて、必要に応じて 10 ～ 30 秒の間で増加させることをお勧めします。たとえば、ウェブサイトに示されているマルチプレックス反応 (139 bp および 962 bp のフラグメントを含む 10 プレックス) では、90 秒の伸長時間が使用されました。

マルチプレックス PCR には高速サイクリング条件を使用しないでください。

AptaLock™ ホットスタートテクノロジーのおかげで、開始から終了まで氷上または冷却ブロック上で反応をセットアップする必要はありません。プライマーは、末端検出法で簡単に分析できる多様なアンプリコン長を維持しながら、配列の重複を可能な限り回避するように慎重に設計する必要があります[1]～[3]。

1. Markoulatos, P., Siafakas, N. & Moncany, M. Multiplex polymerase chain reaction: a practical approach. J Clin Lab Anal 16, 47-51, doi:10.1002/jcla.2058 (2002).
2. Radhika, M., Saugata, M., Murali, H. S. & Batra, H. V. A novel multiplex PCR for the simultaneous detection of Salmonella enterica and Shigella species. Brazilian Journal of Microbiology 45, 667-676, doi:10.1590/s1517-83822014005000041 (2014).
3. Perez-Perez, F. J. & Hanson, N. D. Detection of plasmid-mediated AmpC beta-lactamase genes in clinical isolates by using multiplex PCR. J Clin Microbiol 40, 2153-2162, doi:10.1128/jcm.40.6.2153-2162.2002 (2002).

私の結果には、非特異的なアンプリコンまたはスメアのバックグラウンドが多く含まれています。トラブルシューティングについて何かアドバイスはありますか？

スメアが懸念される場合は、それが最適ではない条件でアガロースゲル電気泳動を実行したことによるアーティファクトではないことを確認することをお勧めします。最適ではない条件には、高電圧やゲルが固まるのに十分な時間を与えないことなどが含まれます[1]。

また、PCR 反応のトラブルシューティングが必要になる場合もあります。その場合は、以下の提案と文献[2]を検討してください。

• プライマーは、プライマー間の相互作用を防ぎ、特異性を向上させるように設計する必要があります
• アニーリング温度を上げるか、アニーリング温度勾配 PCR を実施して最適なアニーリング温度を決定します
• 反応中のテンプレートの量を減らします。高品質の DNA を得るには、50 μL 反応あたり 1 ～ 100 ng のゲノム DNA または 5 ng 以下のプラスミド/ラムダ DNA を使用します
• サイクル数を減らします
• 反応あたりの酵素量を減らします
• プライマー濃度を減らしますが、各プライマーの濃度が 100 nM 未満にならないようにします
• 10x VeriMax Enhancer を追加します
• 最終濃度が 5% ～ 10% になるように反応液に DMSO を含めます

1. Koontz, L. Agarose Gel Electrophoresis. Laboratory methods in enzymology : DNA. First edition. edn, Vol. 529 35-45 (2013).
2. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp, e3998, doi:10.3791/3998 (2012).

私の結果では、収率が非常に低いことがわかりました。トラブルシューティングについて何かアドバイスはありますか？

以下の提案を検討し、文献[1]も参照するとよいでしょう。

• アニーリング温度勾配 PCR でアニーリング温度を最適化します
• 反応中のテンプレートの量を増やしてください
• サイクル数を増やします
• 反応あたりの酵素の量を増やします
• プライマー濃度を上げますが、各プライマーの濃度は 1 µM を超えないようにしてください
• 新しい dNTP ソリューションを試してください
• MgCl₂を最適化してください
• 10x VeriMax Enhancer を追加します

1. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp, e3998, doi:10.3791/3998 (2012).

DNA の GC 含有量が高いため、PCR 産物の収量が低くなっています。この場合、VeriFi^® Hot Start Polymerase の最適な変性温度と時間はどれくらいですか？

GC を多く含む DNA を扱っていて、PCR 産物の収量が低すぎる場合は、変性温度を 98 ～ 100 °C に上げてみてください。VeriFi^® Hot Start Polymerase はこれらの温度に耐えることができ、95 °C での変性に比べて GC 含有量の多い DNA の収量が増えることがわかっています。変性時間は、必要に応じて 10 秒から 30 秒まで変更できます。

10x VeriMax Enhancer を追加すると、GC が豊富なターゲットの増幅にも役立ちます。

VeriFi^® Hot Start Polymerase の異なるフォーマットの違いは何ですか？

VeriFi^® Hot Start Polymerase は 3 つのフォーマットで使用できます。1 つの形式には、酵素 (2 U/µL) と、別の 5x VeriFi バッファーおよび別の 10x VeriMax エンハンサー チューブが含まれています。もう 1 つの形式には、2x ミックスとして事前に混合された酵素、バッファー、およびエンハンサーが含まれています。さらに、2x ミックスには赤色色素も用意されており、アガロースゲル電気泳動中の直接ローディングと追跡がさらに便利になります。すべての形式には、プライマー、テンプレート、PCR グレードの水を除き、PCR に必要な反応成分が含まれています。

アガロースゲル上での Red Mix 色素の見かけの Mw はどれくらいですか？

この非阻害性色素は、ゲルへの直接ローディングを可能にするために添加されており、1% アガロースゲルでは 200 ～ 300 bp、2% アガロースゲルでは 50 ～ 100 bp の DNA フラグメントと同様の速度で泳動します。異なるアガロース含有量のゲルを泳動すると、この見かけの分子量に変化が見られる場合があります。

AptaLock™ テクノロジーとは何ですか？

AptaLock™ は、アプタマー様分子を使用してポリメラーゼにホット スタート活性を与える革新的な独自技術です。これは、抗体媒介ホット スタートの代替方法です。AptaLock™ 分子は、40℃以下の温度で酵素の 3′-5′ エキソヌクレアーゼおよび 5′-3′ ポリメラーゼ活性に可逆的に結合し、阻害します。これにより、プライマー ダイマー形成や非特異的増幅による感度と特異性の損失なしに、室温で反応を開始できます。

VeriFi^® Hot Start Polymerase と VeriFi^® Polymerase / PCRBIO HiFi Polymerase の違いは何ですか？

VeriFi^® Hot Start Polymerase は VeriFi^® Polymerase のホット スタート バージョンであり、PCR Biosystems の革新的な AptaLock™ テクノロジーを使用して、2 つの非ホット スタート酵素と比較して感度と特異性を高めています。VeriFi^® Hot Start Polymerase を使用する場合、反応を室温でセットアップすることもできます。

VeriFi^® Hot Start Polymerase と VeriFi^® Polymerase は両方とも、PCRBIO HiFi Polymerase と比べて処理能力が向上しており、その結果、収率が向上し、より長く (最大 17.5 kb) でより困難なターゲットを増幅することができます。また、どちらの酵素も、PCRBIO HiFi ポリメラーゼよりも忠実度が高くなっています。

PCRBIO HiFi Polymerase とは異なり、VeriFi^® ファミリーの酵素は、ゲルに直接ロードするための赤色色素のオプションを備えた便利な 2x レディ ミックスとしても利用できます。

野生型 Taq DNA ポリメラーゼと比較した VeriFi^® Hot Start Polymerase の忠実度はどれくらいですか？

VeriFi^® Hot Start Polymerase はエラー率が非常に低く、野生型 Taq DNA ポリメラーゼよりも約 100 倍高い忠実度を持っています。

VeriFi^® Hot Start Polymerase の推奨延長時間はどれくらいですか？

真核生物 DNA からの増幅には、1 キロベース (kb) あたり 30 秒が推奨されます。収量が予想よりも低い場合は、この時間を 40 秒/kb まで増やすことができます。伸長時間を 30 秒/kb 未満に減らすことは推奨されません。これは、生成物形成の収量が大幅に減少するためです。テンプレート DNA をロードしすぎないように注意してください。増幅後に非特異的バンドが存在する場合は、テンプレート DNA の量を減らす必要があります。アニーリングと伸長を組み合わせた 2 段階プロトコルも可能です。マニュアルで推奨されている条件と濃度から逸脱する場合は、サイクリング条件とテンプレート濃度の最適化が必要になる場合があります。

VeriFi^® Hot Start Polymerase を使用して生成されたフラグメントでは、どのような種類のクローニング戦略を使用すればよいですか？

VeriFi^® Hot Start Polymerase によって生成された PCR 産物は平滑末端を持っているため、さらなる修飾を必要とせずに平滑末端クローニングに適しています。

A オーバーハングを追加したい場合は、Taq DNA ポリメラーゼまたは Klenow (exo-) DNA を使用し、その後 TA クローニングを行うことができます[1]。Aオーバーハングの追加を進める前に、反応からVeriFi^® Hot Start Polymerase が除去されていることを確認してください。VeriFi^® Hot Start Polymerase が存在する場合、酵素の3’-5’エキソヌクレアーゼ活性によりAオーバーハングが除去されます。

1. Yao, S., Hart, D. J. & An, Y. Recent advances in universal TA cloning methods for use in function studies. Protein Eng Des Sel, doi:10.1093/protein/gzw047 (2016).

10x VeriMax Enhancer はいつ使用すればよいですか？

収率が低い場合、または増幅が観察されない場合は、10x VeriMax Enhancer を反応混合物に添加することをお勧めします。このエンハンサーは、GC リッチ テンプレートや複雑な二次構造を持つテンプレートなど、一部の難しいテンプレートや長いテンプレートでの VeriFi^® Hot Start Polymerase のパフォーマンスを向上させることができます。