RiboShield^® RNase Inhibitor は、さまざまなリボヌクレアーゼの活性をブロックして、サンプルを RNase 消化から確実に保護する組換えタンパク質です。

リボヌクレアーゼ (RNase) はあらゆる種類の細胞や生物に存在しており、その遍在性が研究室で非常に問題になる可能性があります。RNA サンプルに RNase がわずかでも混入すると、RNA は完全に破壊されます。RiboShield^® RNase Inhibitor は、RNase A、B、C を含む幅広いリボヌクレアーゼの活性をブロックし、RNA を RNase 消化から確実に保護する組換えヒト胎盤タンパク質です。

RiboShield^® RNase Inhibitor は、RNA 単離、RT-qPCR、cDNA 合成、RNA シークエンシングなどの RNA に敏感なアプリケーション向けに設計されており、RNA を分解から保護し、その結果、より高い収率とより優れたパフォーマンスを提供します。

この阻害剤は 1:1 の比率で RNase に非共有結合し、非常に速い結合速度で RNA を即座に保護します。RiboShield^® RNase Inhibitor は RT-qPCR でテストされており、主要な競合製品と比較して最も優れた RNA 保護を提供します (参考データ 1 を参照)。

RiboShield^® RNase Inhibitor は、幅広い反応条件で機能し、最高 65°C の温度で少なくとも 30 分間 RNase A の阻害を維持できます (参考データ 3 を参照)。さらに、RiboShield® には、ヒト胎盤タンパク質の酸化感受性に関係するシステイン残基が含まれていません[1]。これにより、熱安定性が高いだけでなく、酸化ストレスに対してより耐性のある RNase 阻害剤分子が得られます。

1. Kim BM, Schultz LW, Raines RT. Variants of ribonuclease inhibitor that resist oxidation. Protein Science. 1999; 8(2):430-434.

この阻害剤を使用すると、中性タイプの真核生物 RNase (RNase A、B、および C) を含む幅広いリボヌクレアーゼの活性をブロックできます。RNase T1、T2、U1、U2、CL3、RNase I、H は阻害しません。この阻害剤は、逆転写酵素、RNA ポリメラーゼ、Taq DNA ポリメラーゼなどの他の酵素を妨げないため、RNA が関与する多くの酵素反応に適合します。

RiboShield^® RNase Inhibitor は分子量 50 kDa で、改変されたヒト胎盤遺伝子を発現する High Five 昆虫細胞から精製されます。この阻害剤は RNase に 1:1 の比率で非共有結合し、RNase A1 に結合するときの Ki 値は約 10 ～ 14 M になります。さらに、RNase との結合速度が非常に速いため、RNA がすぐに保護されます。

RiboShield^® RNase Inhibitor および 3 つの競合製品 (40 U) を、指定量の RNase A および 1 μg RNA とともに 5x UltraScript バッファー中で 37 ℃ で 30 分間インキュベートしました。その後、サンプルを 1% アガロース ゲルにロードしました。L: Ambion RNA Millennium マーカー。使用した RNase 阻害剤は、PCR Biosystems の RiboShield^®、Promega の RNasin^®、Bioline の RiboSafe、および ThermoFisher の RNaseOUT™ です。

RiboShield^® RNase Inhibitor は、テストした阻害剤の中で最も優れた RNA 保護を提供します。

RiboShield^® RNase Inhibitor と競合製品 3 種のそれぞれを 10 種類の希釈度で、5 ng の RNase A と 2 µg の RNA とともに 5x UltraScript バッファーで 37℃で 30 分間インキュベートしました。このステップの後、RNA サンプルは、オリゴ (dT) プライマーを使用した UltraScript 逆転写酵素を使用して逆転写されました。g-アクチンの増幅は、qPCRBIO SyGreen Blue Mix No-ROX を使用して実行されました。使用した RNase 阻害剤は、PCR Biosystems の RiboShield、Promega の RNasin、Bioline の RiboSafe、および ThermoFisher の RNaseOUT でした。各プレートの内部標準を使用して、Ct 値を µg RNA に変換しました。n=4。データは、使用した RNase 阻害剤の濃度あたりの逆転写 RNA の量として、直線 (a) および対数 (b) スケールでプロットされています。使用した各 RNase 阻害剤の IC50 値が計算されました。RiboSshield は、テストした阻害剤の中で最も低い IC50 値を持ち、最も優れた RNA 保護を提供します。

RiboShield^® RNase Inhibitor を、指定された温度で 30 分間インキュベートしました。次に、40 U の阻害剤を 5x UltraScript バッファー中の 1 μg RNA および 5 μg RNase A に添加し、37 °C で 30 分間インキュベートしました。次にサンプルを 1% アガロースゲルにロードしました。RiboShield^® RNase Inhibitor は、最高 65 °C の温度で少なくとも 30 分間、RNase A を阻害できます。

RiboShield^® RNase Inhibitor

保存用の RNA サンプルに RiboShield^® をどれくらい追加すればよいですか？

サンプルの保存には、RiboShield^® RNase Inhibitor を 100 倍溶液として使用することをお勧めします (つまり、保存バッファー内の RNase 阻害剤の濃度は 0.4 U/μL である必要があります)。この最終濃度を超えても下流の酵素反応に悪影響を与えることはありませんが、RNase の汚染が疑われる場合を除き、通常は不要です。

RiboShield^® RNase Inhibitor の使用方法は？

1 ステップおよび 2 ステップ RT-PCR と RT-qPCR、および cDNA 合成用のすべての PCRBIO 製品には RNase 阻害剤がすでに含まれているため、これらの製品を使用するときに RiboShield^® RNase Inhibitor を追加する必要はありません。

他のキットと併用する場合は、20µL の反応混合物に RiboShield^® RNase Inhibitor 1µL (40U) を追加することをお勧めします。RNA のソースに RNase が豊富に含まれていることがわかっている場合は、リボ核酸が完全に保護されていることを確認するために滴定が必要になる場合があります。

RiboShield^® RNase Inhibitor は何に使用できますか？

RiboShield^® RNase Inhibitor は、RT-qPCR、cDNA 合成、RNA-seq などの RNA に敏感なアプリケーションで使用するために設計されています。これらのアプリケーションでは、少量の RNase が存在するだけでも RNA の品質と実験結果に悪影響を与える可能性があります。さらに、抽出された RNA に添加して、RNase 汚染の可能性が高い領域で RNA の品質を維持したり、Pereira ら (2010)[1] で使用されたような RNA 抽出バッファーに添加して、ワークフローを進める際に RNA の完全性の維持を改善したりすることもできます。

1. Pereira MJB, Behera V, Walter NG (2010) Nondenaturing Purification of Co-Transcriptionally Folded RNA Avoids Common Folding Heterogeneity. PLOS ONE 5(9): e12953. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0012953

RiboShield^® RNase Inhibitor はどのような働きをしますか？

RiboShield^® RNase Inhibitor は、RNA 調製物へのリボヌクレアーゼの混入によって引き起こされる可能性のあるターゲット RNA の分解に対するシールドとして機能します。

RiboShield^® RNase Inhibitor を使用するとどのような種類の RNase を阻害できますか？

RiboShield^® RNase Inhibitor は、中性タイプの真核生物 RNase (RNase A、B、C など) を含む、最も一般的で厄介な RNase の活性を非共有結合で阻害するタンパク質ベースの阻害剤です。RNase T1、T2、U1、U2、CL3、RNase I、H は阻害しません。