qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect は、配列特異的プローブを使用した逆転写リアルタイム PCR (RT-qPCR) によるウイルス RNA の超高感度検出用に設計されています。このキットには、cDNA 合成と PCR 増幅を 1 つのチューブで実行できるように最適化された独自のコンポーネントが含まれています。

高濃度 4x ミックス形式で開発された qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect は、各反応により多くのサンプルを追加し、少ない反応容量でも安心して使用できるため、感度と柔軟性が向上します。これは、低コピーのウイルステンプレートの正確で再現性の高い検出が極めて重要であるハイスループットアッセイや臨床診断テストに特に役立ちます。この特殊なキットを使用すると、反応ごとにテストされるコピー数が 4 個 (1 μL あたり 0.8 コピー) までの広範囲の入力 RNA でウイルス配列を正確かつ高感度に検出できます。

幅広い反応温度で作動する UltraScript 逆転写酵素により、迅速かつ効率的な cDNA 合成が実現します。逆転写はわずか 5 分で最高 55°C の温度で実行できるため、GC リッチで高度に構造化されたウイルス RNA 配列の検出が向上します。PCR ステップは PCRBIO HS Taq DNA ポリメラーゼによって実行され、抗体媒介ホット スタート技術を使用してウイルス由来の cDNA を特異的に増幅し、一般的な PCR 阻害剤に対する耐性が向上しています。独自のスマート スクリーン技術を使用して開発された特別に配合されたバッファー システムと組み合わせることで、qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect は、プライマー ダイマーやその他の非特異的生成物の可能性を最小限に抑えながら、堅牢で再現性の高い RT-qPCR を実現します。

qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect は、SARS-CoV-2 核酸の定性的検出用に最適化および検証されており、研究室で開発されたアッセイまたは診断検査キットのコンポーネントとして、新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の臨床サンプルのハイスループット検査に理想的に適しています。検証は、Charité (ベルリン、ドイツ) 推奨のプライマープローブ配列 (RdRp および E 遺伝子)、および米国疾病管理予防センター (アトランタ、米国) のプライマープローブ配列 (N 遺伝子) を使用して実行されています。

qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect には、プライマー、プローブ、RNA テンプレート、水を除き、正確で感度の高い RT-qPCR に必要なすべてのコンポーネントが含まれています。最大限の柔軟性を実現するために、このキットは、TaqMan®、Scorpions®、分子ビーコン プローブなど、さまざまなプローブ技術で使用できるように設計されています。テンプレート RNA の量と品質が許容範囲内であれば、ほとんどの市販キットで抽出した RNA で使用できます。このキットは、マルチプレックス アッセイおよびすべてのリアルタイム PCR プラットフォームと互換性があります。qPCR 選択ツールを使用して、どの ROX バリアントがお使いの機器と互換性があるかを確認してください。

この製品だけでは診断結果は得られず、研究用途のみに提供されています。該当する国の法律で許可されている場合、分子診断アッセイのコンポーネントとして使用するのに適しています。

qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect (紫) と SuperScript III Platinum OneStep qRT-PCR Kit (灰色) を使用し、CDC (N2) および WHO/Charité (E および RdRp-P2) 推奨配列に従って SARS-CoV-2 N、E、および RdRp 遺伝子を増幅しました。増幅曲線は左側に、効率は右側に示されています。RNA テンプレートの 5 つの連続希釈液が使用されました。これは、SARS-CoV-2 ゲノムの 40,000、4,000、400、40、および 4 コピーに相当します。総反応容量は 20μL です。N2 プローブは Cy5、E プローブは FAM、RdRp-P2 プローブは Texas Red でラベル付けされています。サイクリング条件は、RT 55°C 10分、変性 95°C 3分、増幅 95°C 15秒、58°C 30秒の50サイクルでした。

qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect は、三重反応で SARS-CoV-2 を確実かつ高感度に検出でき、競合キットと比較して、より低いテンプレート希釈度でより早いまたは同等の Ct と高い感度が得られます。

CDC 推奨シーケンス N1 (上パネル) および N2 (下パネル) に従って、qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect (紫色の曲線) を使用して SARS-CoV-2 ヌクレオカプシド (N) 遺伝子をシングルプレックスで増幅。増幅曲線は左側に、効率は右側に示されています。SuperScript III Platinum OneStep qRT-PCR (灰色の曲線) を使用して、プレート上で直接比較しました。RNA テンプレートの 5 段階希釈液を使用しました。これは、SARS-CoV-2 ゲノムの 40,000、400、40、および 4 コピーに相当します。総反応容量は 20 µL です。サイクル条件は、55℃ 5 分の逆転写、95℃ 3 分の変性、および 95℃ 15 秒、58℃ 30 秒の 50 サイクルでした。 qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect は、入力 RNA の幅広いダイナミック レンジにわたって高い効率を示し、SuperScript III Platinum OneStep qRT-PCR と比較して Ct が早いか同等です。

CDC推奨のN3プライマープローブ配列に従って、異なる逆転写（RT）時間後にSARS-CoV-2ヌクレオカプシド（N）遺伝子を増幅して得られたCt値（上のプロット）と効率（下のプロット）。qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect（紫色のバー）とSuperScript III Platinum OneStep qRT-PCRキット（灰色のバー）を使用して、プレート上で直接比較しました。RNAテンプレートの3つの希釈液を使用しました。これは、反応あたり40,000、40、4コピーのSARS-CoV-2ゲノムに相当します。総反応容量は20µLです。サイクル条件は、示された時間の55℃でのRT、95℃で3分の変性、および95℃で15秒、58℃で30秒での50サイクルの増幅でした。

qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect (紫) と SuperScript III Platinum OneStep qRTPCR Kit (灰色) を使用して、異なる逆転写 (RT) 時間後に SARS-CoV-2 E 遺伝子配列を増幅して得られた Ct 値と効率プロット。RNA テンプレートの 3 つの希釈度が使用され、反応あたり 40,000、40、4 コピーの SARS-CoV-2 ゲノムに相当します。総反応容量は 20μL です。サイクル条件は、RT 55°C、変性 95°C 3 分、増幅 95°C 15 秒、58°C 30 秒の 50 サイクルでした。

qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect は、競合他社のキットと比較して、より早い Ct と高い効率で、さまざまな RT 時間にわたる SARS-CoV-2 核酸の高感度検出を可能にします。qPCRBIO キットを使用する場合は、シングルプレックス反応の場合は 5 分間の RT、マルチプレックスの場合は 10 分間の RT をお勧めします。

qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect Lo-ROX

qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect Hi-ROX

qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect No-ROX

qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect Separate-ROX

Ct 値がどれくらいの値を超えると結果は信頼できなくなりますか？

Ct 値はテンプレート濃度、反応の最適化、機器、研究室によって異なるため、カットオフ Ct 値を選択する際には注意が必要です。一般的に、35 を超える Ct 値は信頼できないと見なされ始めます。ただし、テンプレートのコピー数が少ない場合、反応が非効率的になると Ct が遅くなることがあります。相対的または絶対的な定量化方法を使用してカットオフを標準化することは常に良い方法です。また、遅く増幅された生成物を特定するために、生成物の融解曲線または電気泳動を実行して分析することをお勧めします。

ROX は反応に悪影響を及ぼす可能性がありますか？

ROX (6-carboxy-X-rhodamine) は、主にウェル間の光路のばらつきによって生じる蛍光レベルの変動を正規化するために、ROX 依存型リアルタイム PCR 機器でパッシブ リファレンス 色素として使用されます。蛍光強度 (Rn) の正規化は、リアルタイム PCR ソフトウェアで、特定の信号の発光強度を ROX の発光強度で割ることによって行われます。

ROX は PCR 反応には関与せず、その蛍光レベルは各ウェルの DNA の量に比例しないため、この蛍光体を混合物に追加すると、増幅中に一定の蛍光信号が得られます。

パッシブ リファレンス スタンダードを必要とするさまざまなタイプのリアルタイム PCR 機器では、主に各システムの光学構成 (つまり、使用される励起源と光学系の種類) が異なるため、ROX の最適濃度が異なります。

ROX の添加量が少なすぎたり多すぎたりすると、非常にノイズの多い信号になり反応の結果に影響を及ぼすため、お客様にとって次のことが非常に重要です:

1. リアルタイム PCR の結果を最適化するために適切な ROX 濃度を決定する
2. 反応を設定するために使用するソフトウェアで ROX 設定を確認する

最も一般的に使用されるシステム用の便利な選択ツールは、こちらにあります。

1 ステップ反応と 2 ステップ反応のどちらが必要ですか？

１-Step

cDNA 合成と PCR 反応の両方が同じミックスで発生します。このオプションは、そのスピードとセットアップの容易さから、高スループット アプリケーションに適しています。汚染のリスクも軽減されます。低品質の RNA サンプルや、cDNA をアーカイブまたは別の分析に必要とする場合は、理想的ではありません。

２-Step

cDNA 合成と PCR 反応は別々に行われます。cDNA 産物を分析用に保持する必要がある場合は、このオプションの方が適しています。また、反応の最適化のレベルも高くなります。酵素の種類と濃度、RNA 入力、cDNA の濃度を制御できるため、1 ステップ形式に比べて感度が高くなります。

RT 反応で RNase 阻害剤を使用する必要はありますか？

いいえ、20x UltraScript® RTase には、劣化を防ぎ感度を高めるための RNase 阻害剤が含まれています。

生成物の低値または遅い Ct 値に関する一般的なトラブルシューティング

Ct 値が異常に遅い場合は、テンプレート RNA を希釈してみてください。これにより、存在する可能性のある阻害物質が反応を阻害しない濃度まで希釈されます。さらに、逆転写ステップを 55 °C に上げ、アニーリング/伸長温度を上げてみてください。これにより、RNA テンプレートやプライマーに存在する二次構造によって生じる問題の解決に役立つ場合があります。

反応阻害が関与している可能性がある場合は、テンプレートの量を減らすか[1]、反応に0.4～4.4 mg/mlのBSAを加えてみてください[2]。

より具体的な問題については、次の情報を添えてお問い合わせください。

• アンプリコンのサイズ
• 反応セットアップ
• サイクリング条件
• 増幅トレースと融解プロファイルのスクリーンショット

1. Scipioni et al. A SYBR Green RT-PCR assay in single tube to detect human and bovine noroviruses and control for inhibition. Virology Journal.5:94 (2008). doi: 1186/1743-422X-5-94
2. Plante et al. The use of bovine serum albumin to improve the RT‐qPCR detection of foodborne viruses rinsed from vegetable surfaces. Applied Microbiology. 52:3 (2010) doi: https://doi.org/10.1111/j.1472-765X.2010.02989.x

qPCRBIO Probe Mix の蛍光が競合他社の製品で得られる蛍光と異なるのは正常ですか？

製品によって蛍光のプラトーが異なる場合があります。ただし、これは定量化の精度には影響せず、Ct 値は製品間で異なりません。

プローブベースのミックスと色素ベースのミックスの違いは何ですか？

qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect などのプローブベースのキットは、感度が高く、非テンプレート増幅が現れる可能性は低くなります。マルチプレックスは、特定のプローブに対して異なる蛍光団を備えたアンプリコンを使用して測定できますが、色素を使用した場合はこれを実現できません。

qPCRBIO SyGreen 1-Step Detect や 1-Step Go などの色素ベースのシステムは、完全な dsDNA を検出するため、プライマー二量体やオフターゲット/非テンプレート増幅を表示します。これらは、融解曲線を分析することで、生成物のピークから分離できます。

ROX とは何ですか? それは必要ですか？

ROX はパッシブリファレンス色素であり、PCR 反応には関与しません。PCR に関連しない蛍光の変動を標準化するために使用されます。「リソース」セクションの qPCR 選択ツールを使用して、どの qPCR ミックスがお使いの qPCR マシンに最適かを判断できます。

qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect ミックスの MgCl₂ 濃度はどれくらいですか?？

すべての 4x qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect ミックスには、18 mM の濃度で MgCl₂ が含まれています。つまり、反応の最終濃度は 4.5 mM です。

どのようなプライミング方法を使用できますか？

遺伝子特異的プライマーは 1 ステップ反応で使用できます。

qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect を使用してマルチプレックス増幅を行う際に考慮すべきことは何ですか？

プライマーは、アニーリング温度が類似し、ターゲットに特異的であり、プライマーダイマーを形成しないように設計する必要があります。逆転写フェーズの長さは、プライミングと増幅に十分なテンプレートを確保するために 10 分まで延長できます。

マルチプレックスを行う場合、各プライマーの推奨濃度はどれくらいですか？

各プライマーは 400～1000 nM の使用をお勧めします。この推奨濃度にはある程度の柔軟性がありますが、プライマー濃度をこの範囲を超えて増加させると酵素の活性に重大な影響を与える可能性があるため、増加させないでください。