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定量的 PCR (qPCR) は、核酸ターゲットの検出および定量化のための最も重要な方法の 1 つです。この手法はリアルタイムqPCRとも呼ばれ、RT-qPCR（逆転写qPCR）とは別物です。従来のPCRと同じ基本的な試薬、酵素、サーマルサイクリング条件を用いますが、反応中の生成物量に比例して蛍光を発生する試薬も追加されます。次に、蛍光光度計を備えた特殊なサーマルサイクラーを使用して、シグナルをリアルタイムで記録します (図１)。この蛍光は、任意蛍光単位（AFU）または相対蛍光単位（RFU）で測定されます。

従来のエンドポイント PCR では、最初のターゲット存在量の半定量的な評価しかできません。これは、DNA ポリメラーゼの生成物の阻害と試薬の枯渇により、PCR 効率が後のサイクルで維持されないことが原因です。逆に、qPCR では生成物の蓄積をリアルタイムでモニタリングできるため、より正確な定量的情報を得ることができます。これは、qPCR反応の蛍光強度をPCRサイクル数に対してプロットすることで生成される増幅曲線から抽出されます。

典型的なqPCR増幅曲線はシグモイド曲線です。最初は、蛍光は線形グラウンド、つまり開始期にバックグラウンドノイズ以下で増加します。産物が指数関数的に蓄積するにつれて、蛍光は比例して増加し、バックグラウンドノイズレベルを超えます。PCR試薬が枯渇するまで、蛍光は各サイクルごとに対数線形に増加し続けます。その後、反応が遅くなるか停止するため、サイクリングプログラムの終了まで蛍光蓄積はプラトー期に達します（図２）。増幅曲線のこの形状に異常がある場合は、反応に問題があることを示しています。このような異常の解釈方法と修正に必要な手順の詳細については、セクション９の「トラブルシューティング」を参照してください。

qPCR 増幅曲線から得られる最も価値のある測定基準は、いわゆるしきい値サイクル (Ct) または定量化サイクル (Cq) です。これは、ターゲット産物によって生成された蛍光シグナルがバックグラウンドノイズを上回る任意のしきい値レベルを超えるPCRサイクルに相当します（図２）。この Cq 値は初期ターゲット濃度に比例し、異なるサンプル間でターゲットの量を比較するために使用できます。あるいは、既知のターゲット量を使用したリファレンスサンプル Cq の標準曲線と比較して、初期テンプレートの定量化を可能にすることもできます。

色素ベースの検出とプローブベースの検出という 2 つの異なる化学戦略を使用して、蛍光を介した生成物の蓄積のリアルタイムモニタリングを可能にすることができます。

PCR産物をリアルタイムで検出するこのアプローチは、二本鎖DNA分子にインターカレーション可能な蛍光色素を添加することで実現します。この色素自体は溶液中で遊離している状態で一定の蛍光を発しますが、DNA塩基対間に同数の色素分子が重なると蛍光の強度が劇的に増加します。したがって、qPCR反応の開始時には、遊離した色素から一定の蛍光が発せられるのに加え、反応開始時に二本鎖DNAにインターカレーションされている少量の色素（本来は少量であるべき）が蛍光を発します。

PCRが進むにつれて、サンプル中の二本鎖DNA（dsDNA）の量が増加します。対応して、フリーの色素に対するインターカレートされた色素の比率が増加し、蛍光強度も比例して増加します (図３)。数サイクル後、PCR 反応の速度が低下して停止するため、蛍光はプラトーに達し、前述した蛍光のシグモイド曲線が生じます。多くの場合、特に旧式のqPCR装置では、qPCRミックスにパッシブ色素（通常はROX）を追加することで、実行中の蛍光シグナルの変動を標準化します。

融解曲線解析により、qPCR産物の融点を特定できます。この情報は、qPCR産物の特異性を確立するための指標として有用です。融解曲線解析を行うには、qPCRサイクリングプログラムの最後にサーマルサイクリングステップを追加します。このステップでは、インキュベーション温度を徐々に上昇させ（通常50～55℃から95～99℃）、反応サンプルをゆっくりと変性させます。その間、蛍光は0.1～0.5℃ごとに段階的にカウントされます。温度に対してプロットされた蛍光強度の累積データポイントが融解曲線となります。

特定の生成物を含む反応では、温度がターゲット物質の融点に近づくまで蛍光は一定に保たれ、その後急速にベースラインまで減少します。蛍光が最大値の50%に低下した点が、その分子のTm値とみなされます（図５）。

リーディングピーク、歪んだピーク、または複数のピークはすべて、反応中に非特異的な生成物が蓄積していることを強く示しており、テンプレートの定量分析を行う前にさらに調査する必要があります (図 ６)。

異常な融解ピークは、オフターゲットプライミングやプライマーダイマーまたはプライマーヘアピンの形成によって形成される複数の生成物など、複数の生成物が反応中に蓄積する場合にも観察されます。反応中に複数の産物が存在すると、それぞれ異なる温度を中心とする、通常は異なる融解ピークが複数生成されます（図７）。場合によっては、複数の生成物が二重ピークまたはリーディングピークとして表示されることがあります。プライマーダイマーまたはヘアピンは通常、全長の産物よりも低い温度で現れますが、必ずしもそうとは限りません。

他の産物が存在しない場合でも、特定のアンプリコンが二重ピークを生成する場合があります。これは、アンプリコン配列の異なる領域でGC含量が大きく異なる場合に発生することがあります。このような不均一な塩基対含量により、まずGC含量の低い領域が部分的に変性し、続いてGC含量の高い領域が高温で変性し、最終的に2つの異なるピークが現れます。注目すべき例として、哺乳類のCFTR遺伝子^２が挙げられます。この現象はまれですが、qPCR分析を行う際には注意が必要です。

qPCR プローブには、加水分解プローブ、デュアル ハイブリダイゼーション プローブ、ヘアピン プローブという異なる作用機序に基づいた 3 つタイプがあります。これらのいずれの手法においても、蛍光検出はFRETと呼ばれる物理現象を利用しています。本稿では主に加水分解プローブ（TaqMan®プローブとも呼ばれます）に焦点を当てますが、網羅性を高めるため、他の種類についても簡単に説明します。

加水分解プローブ
加水分解プローブを使用したターゲット生成物の検出は、ターゲット分子の一部に相補的になるように設計されたオリゴヌクレオチドプローブを追加することによって実現されます。プローブは共有結合により修飾され、一方の端には蛍光団が含まれ、もう一方の端にはその近傍でのみ蛍光団から放射される光を吸収（消光）する消光分子が含まれます。バックグラウンドシグナルを低減するために、2つ目のクエンチャー分子（プローブ配列の途中に添加）が必要となる場合もあります。また、このプローブは、ターゲット分子の増幅に用いるプライマーペアと同程度のアニーリング温度となるように設計されています。

qPCR反応液に添加した直後は、クエンチャーが蛍光シグナルを吸収するため、蛍光シグナルは生成されません。サーマルサイクリング プログラムが開始されると、プログラムの変性/アニーリング段階でプローブがターゲットとアニーリングします。伸長中、新しい DNA 鎖を生成するポリメラーゼは、5′-3′ エキソヌクレアーゼ活性を通じてアニーリングされたプローブを分解し、反応ミックス中のクエンチャー分子と蛍光分子を遊離します。これにより、これら2つの分子間の距離が大幅に広がるため、蛍光分子は刺激を受けると検出可能な蛍光シグナルを発します（図３）。

各サイクルが繰り返されるにつれて、ターゲット DNA 分子の量が増加すると、分解されるプローブの量が増加し、放出された蛍光分子から放出される蛍光シグナルがますます増加します。これにより、各サイクルから一連のデータポイントが生成され、予想されるシグモイド曲線が得られ、そこからCqサイクル値が算出されます。色素ベースの検出と同様に、蛍光シグナルの変動を正規化するためにパッシブリファレンス色素を含めることができます。

ヘアピンプローブ（モレキュラービーコン）
ヘアピンプローブ（モレキュラービーコン）検出では、加水分解プローブと同様に、クエンチャー分子と蛍光分子を運ぶように共有結合的に修飾された 1 つのプローブを利用します。ただし、この配列はヘアピン構造を形成するようにも設計されており、共有結合で修飾された塩基が近接するため、プローブがヘアピンを形成してターゲットに結合していないときに、強力な蛍光色素消光が確実に行われます。このタイプのプローブには、クエンチャーと蛍光分子の相対位置が異なる様々なバリエーションが存在し、ヘアピンが変性段階で分離されるかアニーリング段階で分離されるかによってシグナル発生のタイミングが異なります¹。

デュアルハイブリダイゼーションプローブ
デュアルハイブリダイゼーションプローブは、qPCRターゲットに特異的な2つのプローブの存在を前提としています。どちらもターゲットの同じ鎖上の隣接するセグメントに連続的に結合するように設計されており、最初のプローブは 3’ 末端に FRET ドナー分子を運ぶように共有結合修飾され、2 番目のプローブは 5’ 末端に FRET アクセプター分子を運ぶように共有結合的に修飾されています。両方のプローブがターゲットに結合し、ドナー分子が適切な励起波長によって刺激されると、FRET を介して励起エネルギーがアクセプター分子に移動し、次に、対応する波長で蛍光が発せられ、qPCR 機器によって記録されます。

アクセプター分子とドナー分子は、両方のプライマー上で逆の順序で設計できます。ただし、両方のプローブがターゲット分子に結合した際に、それらが互いに隣接している必要があります。デュアルプローブシステムでFRETが十分に機能するには、アクセプター分子とドナー分子が10Åの半径内に存在する必要があります。つまり、プローブはターゲット分子上で互いに隣接して（3bp未満で）結合する必要があります。

プローブがターゲット分子にアニーリングした後にのみ蛍光が発生し、非特異的産物によってシグナルが発生しないため、より高い特異性が実現されます。これは、結合する二本鎖DNA配列に関係なくシグナルを生成するインターカレーティング色素とは異なります。

この特異性と異なる蛍光色素の使用可能性により、このシステムは、単一のqPCR反応ミックスで複数のターゲットを同時に検出するマルチプレックス反応の構築に使用できます。これは、スペクトル的に異なる蛍光色素で標識された特異的オリゴヌクレオチドプローブを添加するだけで実現され、各プローブは1つのサンプル中の別々のターゲットについて特異的な定量情報を提供します。マルチプレックス化は、研究および診断の両面において、サンプル中の複数のターゲットを効率的かつ正確に定量できる非常に有用なアプローチです（図４）。

プライマーダイマー、ヘアピン、またはプローブの二次構造は、プローブベースの qPCR にも影響します。これは、そのような構造の形成により、実際のターゲットに結合するために利用できるプライマーとプローブの量が減少するためです。この競合は通常、Cqの遅延を引き起こします。

色素ベースの検出方法とプローブベースの検出方法には、どちらも特有の利点と欠点があります。特に重要なのは、どちらの方法も過剰なサイクリングに起因するPCRアーティファクトの影響を受ける可能性があることです。ただし、色素ベースのqPCRは、このようなアーティファクトの影響で誤ったデータを生成する可能性がより高くなります。「トラブルシューティング」のセクションでは、これらの問題について説明します。

ターゲット領域は、qPCR 反応の効率と特異性を最大限に高め、生物学的に意味のある明確な結果を生成するように選択する必要があります。つまり、

• ターゲット領域は、テンプレート サンプル内で固有である必要があります。言い換えれば、サンプル中の宿主生物または他の汚染生物のゲノムまたはトランスクリプトームの他の領域と相同性が低い必要があります。
• ターゲットの GC 含有量は、理想的には 30 ～ 70% である必要があります。

転写ターゲットに複数のスプライスバリアントがあることがわかっている場合、バリアント間の区別が望まれない場合を除き、異なるエクソンのスプライスジャンクションにまたがるようにターゲット領域を選択する必要があります。これにより、異なるスプライスバリアントを異なるアンプリコン長に基づいて検出することが可能になります。アンプリコン長は、qPCR後に評価することも、qPCRの前に同じプライマーペアを用いて標準的なPCRで評価することもできます。

非常に類似した転写産物または遺伝子の場合、プライマーが最も多様性の高い領域に位置し、その配列が差異を示すヌクレオチドで終結するようにターゲットを選択する必要があります。これは、類似性の高い転写産物の 5 ‘ または 3’ UTR、または類似性の高い gDNA ターゲットのイントロンに存在する可能性があります。

プライマーは、二次構造（ヘアピン、自己二量体、またはクロス二量体）を回避または最小限に抑えるように設計する必要があります。これは、インターカレーション色素ベースの qPCR 検出 (すべての dsDNA 構造がシグナルを生成し、二次構造が分析にアーティファクトを導入します) とプローブベースの qPCR 検出 (プライマーが反応において制限試薬となり、効率と感度が低下します) の両方にとって重要です。実際、反応効率を最大化するには、二次構造を回避することが重要です。最適な設計を実現するには、適切な二次構造予測ソフトウェアを常に使用する必要があります。市販の Beacon プライマー設計プログラムの無料オンライン バージョン^３や Primer3^４ などのツールは、オンラインで入手できます。ゲノムおよびトランスクリプトームデータベースに対するPrimer BLASTは、可能な限り最適なプライマーセットを特定し、高い特異性を確保するために、複数の適切なプライマーペアを用いて実施する必要があります。

これらの一般的な考慮事項に加えて、さらに次のような設計上の特徴があります。

• プライマーの長さは18～25bpにする必要があります
• 両方のプライマーのアニーリング温度が最適になるように、プライマーの Tm 差は 2°C を超えてはなりません
• 3’ 末端に 1 つまたは 2 つの G または C 残基（3’ アンカーと呼ばれる）を持つプライマー配列を選択します。
• プライマーは、アンプリコン長が80～250bpとなるように設計する必要があります。理想的には、この範囲の短い方です。qPCR で信頼性の高いデータを得るには、PCR 効率が可能な限り 100% に近づく必要があり (ターゲットの完全な 2 倍化を示します)、増幅効率はターゲットの長さと逆相関します。
• 真核生物の遺伝子転写物 (cDNA) を検出するためのプライマーを設計する場合、エクソンのスプライス結合部分にまたがるプライマーを選択することをお勧めします。これにより、2 つのエクソン間に未切除のイントロンが含まれるため、混入したゲノム DNA が qPCR 中に増幅されることはありません。
• 新しいターゲット用のプライマーを設計するときは、2 ～ 3 組のプライマー ペアを選択してラボでテストします。
• プライマーは、qPCRミックスのメーカーが推奨する量で反応液に添加してください。各プライマーの最終濃度は通常300～900 nMですが、反応を最適化するためにこの範囲内で調整することができます。

オリゴヌクレオチドプローブを設計する際の考慮事項はプライマーの場合と同じですが、いくつかの追加パラメータがあります。

• プローブ配列は可能な限り特異的である必要があり、テンプレートサンプル内のオフターゲット領域またはプライマーと交差反応しないようにする必要があります。
• 増幅中はプローブがテンプレートに結合したままでなければならないため、プローブのアニーリング温度は増幅プライマーの温度より 5 ～ 10 °C 高くする必要があります。
• グアニン残基は蛍光体を消光する可能性があるため、配列の GC 含有量は 30 ～ 80% とし、G よりも C を多く含むように設計する必要があります。
• 極めて重要なことは、プローブ設計中は 5’G 残基を避けるべきであるということです。この残基には蛍光体が加水分解後も結合したままであり、DNAポリメラーゼによるプローブ分解後にシグナルが消光する原因となります。
• プローブは高品質かつ高純度である必要があります（例：HPLC精製または同等の精製）。プローブを用いたqPCR実験を初めて行う場合は、様々なサプライヤーと精製方法を試し、アプリケーションに最適なものを特定する必要があります。
• 使用する蛍光色素とクエンチャー分子は適合性がある必要があります（表2）。選択した蛍光色素は、使用するqPCR装置で検出可能でなければなりません。FAM色素は最も適合性の高い蛍光色素であり、ほとんどのサプライヤーから入手可能です。そのため、シングルプレックスプローブに適しています。マルチプレックス反応用のプローブを設計する場合は、以下のセクション3.4「マルチプレックスqPCRの設計」のヒントを参照してください。
• 反応中の個々のプローブの最終濃度は、qPCRミックスメーカーの推奨量から始めて、100～500 nMの範囲にする必要があります。反応を最適化するために、必要に応じて濃度を調整してください。

マルチプレックス qPCR 反応は、プローブベースの検出にさらなる利点をもたらします。異なる蛍光色素を持つプローブを用いることで、同一反応で複数のターゲットを定量することが可能になります。

しかし、マルチプレックス化には、慎重な実験設定によって最小限に抑えるべき課題も存在します。シングルプレックスにおけるプライマーとプローブの設計、そしてターゲットの選択について説明した考慮事項は、マルチプレックスqPCRにも当てはまります。

個々のターゲットの存在量を評価するには、各プローブとプライマー セットの効率をシングルプレックス アッセイでテストし、次にマルチプレックスでテストする必要があります。したがって、1 つのターゲットが他のターゲットと 3 Cq 以上異なる場合、およびマルチプレックス アッセイで特定のセットの効率が低下する場合は、問題となっている反応を最適化するための措置を講じる必要があります。または、追加のプライマーまたはターゲットを検討する必要があります。

プライマーの検証
プライマーの検証は、実験で使用されるのと同じタイプのアンプルで実行する必要があります。例えば、ゲノムDNAを試験する場合はgDNAサンプル、cDNAサンプルを使用する場合は逆転写RNAサンプルを使用する必要があります。プライマーは、予測されるプライマーペアのTm付近のアニーリング温度勾配を用いた標準PCRまたはqPCRで試験し、増幅アーティファクトを生じずに使用できる温度範囲を評価する必要があります。

完了後、たとえテストqPCRで融解曲線解析を実施済みであっても、反応はアガロースゲル電気泳動をする必要があります。潜在的なアーティファクトとしては、プライマーダイマーやヘアピンに起因する低分子量で短い（100 bp未満）産物、およびミスプライミングによる非特異的なターゲット増幅に起因する長いアンプリコンなどが挙げられます。アーティファクトが認められる場合は、アニーリング温度範囲を可能な限り高くし、サイクル数を最大35～38サイクルに減らしてください。それでもアーティファクトが発生する場合は、サンプル調製方法（例：RNAサンプルに残留DNAが存在しない、またはサンプルのコンタミネーションが発生していない）を見直した上で、ターゲットの異なる領域に対して新しいプライマーを設計する必要があります。

プライマーをテストする場合、精製されたターゲットまたはプラスミドベクターにクローン化されたターゲットの使用は推奨されません。アーティファクトの明らかな原因は、実験サンプル中に存在する非ターゲット核酸のミスプライミングまたはオフターゲットプライミングであるためです。精製されたターゲットが検証に使用される場合、この情報は失われます。ただし、精製されたターゲットは反応のポジティブコントロールとして役立ちます。

反応効率
反応効率は、既知量のターゲットを含むサンプルの希釈系列に対して qPCR を実行し、各サンプルで観察された Cq に対してターゲット量の対数をプロットし、得られたデータ ポイントを通じて線形方程式をカーブ フィッティングすることによって計算されます。これにより、図８に示すようなデータが生成されます。

前述したように、プライマー ペアの効率は 90 ～ 110% でなければなりません。100%未満の効率は、通常の条件下では各サイクルでターゲット配列が完全に倍加することは稀であるという生化学的事実を反映しています。100%を超える効率は通常、反応阻害物質が存在する場合に観察され、各希釈度の効率を異なる程度に変化させます。

標準曲線から計算される追加パラメータは、相関係数 (R2) です。相関係数は、曲線がデータ ポイントにどの程度適合しているかを示し、理想的には完全に適合していることを示す 1 (または 100%) である必要があります。また、そのプライマー ペアを使用した qPCR の検出限界を理論的に予測する Y 切片もあります (図 8)。

名前が示すように、qPCR では既知の配列を持つ核酸ターゲットの定量化が可能です。qPCR実験の設定方法に応じて、DNAとRNAの両方のターゲットを定量化でき、絶対単位、質量単位、またはテンプレート分子のモル数（コピー数）で定量情報を得ることができます。また、qPCRは相対的な定量データも提供します。この場合、測定単位は、同一サンプル中の1つ以上の他のターゲット分子に対するターゲット分子の量、および／またはリファレンスサンプル中に存在するターゲットの存在量に対する相対的な量を反映します。

どちらのアプローチも、生物学的に意味のある情報を計算する際に Cq 値を利用します。ただし、qPCR データに関するすべての比較および統計分析は、Cq 値自体ではなく、上記の定量化方法のいずれかから導出された単位で行うことが重要です。これは、Cq 値は単なる機器の出力であり、直接比較すると誤った結論につながる可能性があるためです。さらに、Cq値は対数スケールでの差を反映しており、1つのCq差は実際のターゲット存在量の2倍の差を反映します。したがって、サンプル間の Cq の小さな差が、ターゲット量の大きな差を反映している可能性があります。

以下ではそれぞれの定量化アプローチを、それぞれの長所と短所とともに詳細に説明します。

qPCR でターゲット分子の絶対定量を達成するには、既知量のターゲット分子を含む一連の標準リファレンスサンプルが必要です。標準サンプルは、過去の実験でターゲット分子の存在量が推定されている実験サンプル、または精製されたターゲット分子（PCRおよびゲル抽出によって生成されたもの、あるいはベクターにクローニングされたもの）のいずれかです。ただし、前述のように、後者のアプローチは推奨されません。

種類に関係なく、標準サンプルを使用して、生物学的に関連するターゲット存在量を検出不可能なレベルにまで広げるのに十分なデータ ポイントを含む希釈シリーズを生成します。これらのサンプルは、評価対象の実験サンプルと共にqPCR実験に使用されます。次に、標準サンプルの希釈系列を使用して、反応効率の計算について前述したように標準曲線を作成します。次に、標準曲線に最もよく適合する線形方程式を使用して、実験的に観察された Cq に基づいて実験サンプル中に存在するターゲットの量を推定します (図８)。

したがって、このアプローチは、実験に1つまたは2つのターゲット分子の絶対値が必要な場合に最適です。逆に、多数のサンプルにわたって複数のターゲットを評価する場合、このアプローチの効率は大幅に低下します。

このアプローチでは、qPCRを用いて、ターゲット分子の存在量をリファレンス分子（複数可）に対する相対的な存在量を推定します。相対定量は主に遺伝子発現研究で用いられますが、以下に述べる基準を満たす場合は他の用途にも拡張可能です。この手法の根拠は、あらゆる生物において特定の遺伝子がほとんどの実験条件下で安定した発現レベルを維持し、そのため実験的処理を施しても転写産物の存在量に大きな変動がないという経験的観察に基づいています。これらはハウスキーピング遺伝子として知られており、その存在量が実験内のすべてのサンプルで同様であるため、リファレンス遺伝子として適しています。

相対定量を達成するために、実験のすべてのサンプルについてターゲット遺伝子とリファレンス遺伝子の両方の Cq 値が qPCR によって測定され、ターゲット遺伝子の存在量がリファレンス遺伝子の発現の割合として計算されます (図９)。

この値はターゲット分子の絶対数に関する情報は提供しませんが、サンプル間で類似しているリファレンス遺伝子の値に正規化されているため、サンプル間でターゲットの存在量を比較することができます。このアプローチで有意義な実験データを取得するには、選択したリファレンス遺伝子が、特定の実験で使用されるすべての条件と処理において実際に安定していることを確認することが重要です。これは、事前の実験、トランスクリプトミクスデータセットから確立、または標準曲線を用いた絶対定量によって検証される必要があります。哺乳類で一般的なリファレンス遺伝子には、ACTB（アクチンB）、GAPDH（グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ）、18S rRNA遺伝子などがあります^５。哺乳類のリファレンス遺伝子のリストはオンラインで入手できます^６。植物における一般的なリファレンス遺伝子は、ユビキチンリガーゼ（シロイヌナズナでは UBQ10、マメ科植物では UBQ1）、TBC（チューブリン C）、EF1a、および PP2A（タンパク質ホスファターゼ 2 A）です^７。ここに記載されていない他の遺伝子は、異なる生物、組織の種類、または実験条件に適している場合があります。

サンプル間の正規化にはリファレンス遺伝子が最もよく用いられますが、相対定量実験では他の安定したパラメータも使用できます。例えば、サンプル質量、qPCRにおける総核酸量、あるいは選択された実験条件下で変化せず、実験誤差やバイアスを最小限に抑える類似のサンプル特性などが挙げられます。

qPCR を最も効率的に使用して生物学的に意味のあるデータを生成するには、従うべき手順が数多くあります^８。

１．どのターゲットを分析に含めるかを検討します。

２．必要な実験条件、処理、および時点を列挙します。

３．絶対定量を行う場合は、研究対象のターゲットが既知量で存在するリファレンスサンプルを用意してください。相対定量を行う場合は、研究条件下で安定な適切なリファレンス遺伝子を特定してください。リファレンス遺伝子が入手できない場合は、サンプル量に応じて、外因性のリファレンスターゲットをサンプルに添加することを検討してください。

４．ターゲット遺伝子およびリファレンス遺伝子のプライマーを設計および検証するか、文献で特性評価されているプライマーを使用します。後者の場合でも、プライマーの効率と特異性をテストし、それらが報告通りに機能することを確認する必要があります。

５．各実験条件で使用する生物学的複製 (異なる個体、細胞培養、またはコロニーの数) および技術的複製 (同じテンプレート サンプルでの反応の数) の数を計算します。必要に応じて、統計的検出力検定を使用して、ターゲット発現における統計的に有意な変化を特定するために必要な生物学的複製の最小数を確立します。生物学的複製の絶対最小値は 3 であり、これは文献で一般的に報告されていますが、これは代表的で生物学的に意味のある結果を保証するのに決して十分ではなく、盲目的に適切であると選択すべきではありません。技術的複製の数は通常 2 ～ 3 ですが、強い技術的変動の原因が疑われる場合は、それ以上になる可能性があります。絶対定量実験を行う場合は、標準曲線サンプルを含めることを忘れないでください。通常、標準サンプル希釈系列は、ターゲット分子コピー数 108 から 100 までの範囲であり、テンプレートなしコントロール (NTC) が含まれます。ただし、上限は経験的に推定し、必要に応じて変更できます。

６．必要なコントロールサンプルを特定します。反応ミックスの活性をテストするためにポジティブコントロールサンプルを含めます。プライマーペアごとにテンプレートコントロール（NTC）を含め、すべてのプレートで実行する必要があります。同じ実験で複数のプレートを実行する場合は、解析中のプレート内変動を最小限に抑えるために、プレート内コントロールとして使用できるポジティブコントロールサンプル／ターゲットを検討してください。cDNAサンプルを使用する場合は、結果を歪める可能性のあるgDNAやその他のテンプレートの混入の影響を計算するために、逆転写コントロール（NRT）を含めないでください。

７．最も正確な生物学的結果が得られるサンプルを選択してください。例えば、器官全体または生物体全体からの核酸の一括抽出は、局所レベルまたは組織レベルでの転写変化をマスクする可能性があります。特定の細胞や組織の種類を解剖または選択することで、ターゲットレベルにおける局所的な差異が明らかになる場合があります。可能であれば、サンプルは同一条件下で採取し、急速凍結して抽出まで-70℃未満で保存してください。

８．サンプルの取り扱いと調製が最適であり、可能な限り最高品質のサンプルが得られるようにしてください。RNA は特に分解しやすいため、遺伝子発現や診断分析に重大な影響を与える可能性があります。DNA はより安定していますが、サンプルが保護されるように注意する必要があります。A₂₆₀/A₂₈₀ > 1.8 および A₂₆₀/A₂₃₀ > 2.0 の高純度の核酸が得られる精製方法を選択してください。アガロースゲル電気泳動またはキャピラリーフロー分析 (例: RIN Bioanalyzer) により、精製サンプルの完全性を確認してください。RNA サンプルは、コンタミネーション DNA を除去するために DNase で処理し、エンドポイント PCR または下流の qPCR に NRT コントロールを含めることで DNA がないことを確認する必要があります。すべてのサンプルに対して同じ方法を使用して、総 DNA または RNA を定量してください。異なる方法で生成された値を使用しないでください (例: 同じ実験内で UV 吸光度と色素ベースの定量結果を比較しないでください)。

９．qPCRプレートの準備ができたら、汚染源や技術的エラーを最小限に抑えるようにしてください。可能であればクリーンベンチ内、または少なくともラボ内の専用エリアで作業してください。可能な場合はリキッド ハンドリング ロボットを使用します。各プライマー セット (および該当する場合はプローブ) のマスターミックスを準備し、すべてのサンプルに必要なマスターミックスが余っていることを確認します。

１０．サンプルを qPCR マスターミックスと組み合わせる場合は、大量のサンプルを使用するのが理想的です。一般的に使用されるサンプル量は、qPCR 反応の 10～20% です。これは、20 μL の総反応量中 2 ～ 4 μL となります。可能であれば、マスターミックスとサンプル希釈液がサンプル量に対して約60～40%の割合で混合されるように調製してください。これにより、同じピペットをピペッティング量の中間値でセットアップに使用できるため、ピペッティングエラーを最小限に抑えることができます。また、マスターミックスとサンプルの混合もより良好になります。ウェルが適切に閉じられ、シールされていることを確認し、適切な遠心分離機でプレートをスピンダウンし、ウェル内に気泡がないことを確認してください。気泡があると、サーマルサイクリング中に蛍光異常が発生します。

１１．製品マニュアルの推奨に従ってサーマルサイクリングプログラムを実行し、実験用プライマーの検証時に最適と判断したアニーリング温度を選択してください。必要に応じて、サーマルサイクリングプログラムの最後に融解曲線測定ステップを含めてください。融解曲線測定の正確な設定は機器によって異なりますが、通常は付属ソフトウェアにプリセットされています。該当するマニュアルをご参照ください。

１２．取得後、増幅プロットや融解曲線に明らかな問題がないか、またNTC​​およびNRTコントロールにアンプリコンが存在しないか、結果を評価してください。解析前に、これらの問題が発生した場合は記録しておいてください。この時点で問題が見つかった場合は、「トラブルシューティング」セクションを参照して適切な解決策を見つけてください。通常、すべてのテストサンプルの測定後、5サイクル以上経過してもNTCに生成物が蓄積している場合は許容範囲内とみなされ、解析を正常に行うことができます。ただし、このような生成物がターゲットとは区別され、テストサンプルに存在しないことを確認することをお勧めします。多くの場合、これらはプライマーダイマーです。

qPCR の実行に明らかな問題がない場合 (上記のポイント 11 を参照)、実行データをエクスポートして分析できます。ほとんどの qPCR 機器はしきい値を自動的に定義し、すべてのサンプルの Cq 値を生成します。このしきい値は手動で高くまたは低く調整できますが、Cq 値に誤りが生じる可能性があるため、経験の浅いユーザーには推奨されません。分析からサンプルを除外する上限 Cq 値を設定します。35～40 サイクルを超える Cq 値は、入力テンプレートの量が非常に少ない (反応開始時のターゲット コピー数が 10 未満) ことを意味します。このような濃度では、最初の qPCR サイクルでの増幅はほぼ確率的であり、技術的な変動が大幅に増加します。多くのサイクルを伴うより長いプログラムでは、より多くのアーティファクト、プライマーダイマー、ミスプライミング生成物、不完全なターゲットフラグメントも導入されるため、より高い Cq 値が必ずしも真のターゲット量を反映するとは限りません。一般に、40 を超える Cq 値には疑問がありますが、分析に含めるか除外する前に、ターゲットの特異性を慎重に評価する必要があります。絶対定量法と相対定量法のどちらを行うかによって、正確な計算方法は異なります。以下に、それぞれの方法の手順を概説します。

絶対定量では、各技術的複製の Cq が標準曲線と比較され、そこから入力テンプレートの量が計算されます。最新のソフトウェアのほとんどは、標準曲線を自動的に作成し、計算と対数変換を行い、初期サンプル量を適切な単位（ng、コピー数、または単位体積あたりのモル数）でエクスポートします。これらの単位は線形スケールであるため、生物学的レプリケートの記述統計量を直接計算し、選択した存在量単位を用いて直接統計解析を実行できます。

ただし、エクスポートされた Cq データの分析を自分で実行したい場合は、次の手順を実行する必要があります。

１．エクスポートされた Cq 値と各リファレンスサンプル希釈の開始量の log₁₀ 値を使用して標準曲線をプロットします。

２．データに最もよく適合する線を見つけます。Microsoft Excel、R、Pythonスクリプトなど、様々なプログラムで行うことができます。この最もよく適合する直線を表す方程式を取得し、その傾きと Y 切片に注目します。

３．各実験サンプルの技術的複製の平均値を計算します。

４．ステップ 2 で生成された標準曲線方程式を使用して、ステップ 3 の各実験サンプルの平均 Cq を入力し、各サンプルの log₁₀ 開始量を計算します。

５．ステップ 4 で計算された log₁₀ 開始量に 10 を累乗して、実際の実験サンプルの開始量を導き出します。

６．記述統計を計算し、実際の開始量に対して統計解析を実行して、実験的結論を導き出します。

ΔCq 法

ΔCq 法では、ターゲット遺伝子とリファレンス遺伝子の Cq値 の差が式 (1) に従って計算されます。

ΔCq = Cq(Target )–Cq(Reference) (1)

そして、ターゲット遺伝子の相対発現は次のように計算されます。

E^-ΔCq (2)

ここで、Cq(Target ) と Cq(Reference) は、それぞれ同一サンプル中のターゲット遺伝子とリファレンス遺伝子についてqPCRで得られた実験的Cq値であり、E は反応効率です。理想的なシナリオでは、ターゲット遺伝子とリファレンス遺伝子の両方の反応効率が100%であるため、E = 2となります。これはLivakとSchmittigenが最初に用いた手法であり、実験効率が高い場合には依然として貴重な実験情報を提供します^９。しかし、反応効率が100%を大きく下回る場合には不正確であると批判されてきました。

実験的に計算された効率も式(1)に使用できますが、ターゲット遺伝子とリファレンス遺伝子の両方で同じか非常に類似している場合に限られます。実験的に計算された効率（標準曲線経由）の代替として、各反応の効率を数学的に計算する方法があります（各サンプルの増幅プロットにおけるCqデータと対数蛍光データの線形回帰分析）。このような反応効率計算用のフリーソフトウェアが利用可能であり^１０、qPCR機器に付属する一部の市販ソフトウェアパッケージにも含まれています。この計算された効率は、式(1)のEの値として使用できます。反応効率（理論的または実験的に計算されたもの）がターゲット遺伝子とリファレンス遺伝子の両方で同程度であると仮定すると、平均効率を式(1)のEの値として使用できます。このアプローチは、ターゲット分子とリファレンス分子の計算された効率が大きく異なる場合には使用すべきではありません。どの方法を用いるかにかかわらず、生成された相対発現値により、サンプル間でのターゲットの発現の比較だけでなく、同じリファレンス遺伝子に正規化された他のターゲットの発現との比較も可能です。したがって、これは複数のターゲットを用いた遺伝子発現解析を行うための非常に汎用性の高いツールです。

ΔΔCq法

ΔΔCq法では、リファレンス遺伝子に加えて、正規化のためのサンプルを使用します。そのために、式 (1) に従ってすべてのサンプルの ΔCq 値が計算され、その後、以下の式 (3) に従って、各テスト サンプルの ΔCq がリファレンス/ノーマライザー サンプルの ΔCq に正規化されます。

ΔΔCq = ΔCq(Test) – ΔCq(Control) (3)

コントロールサンプルと比較した遺伝子発現の倍率変化は次の式で求められます。

E^-ΔΔCq (4)

ここで、ΔCq(Test) と ΔCq(Control) はそれぞれ、テストサンプルと、他のすべてのサンプルを正規化するコントロールサンプルまたはリファレンスサンプルの ΔCq 値です。E は、ターゲット遺伝子とリファレンス遺伝子の両方の計算された平均効率です。これは次のようにも表すことができます。

2^-ΔΔCq (5)

リファレンス反応とターゲット反応の両方に対して完全な効率を仮定した場合。この方法では、すべてのサンプルのターゲット遺伝子の相対発現値が、選択されたコントロールサンプルと比較した倍率変化として与えられます。コントロールサンプルの倍率変化値は常に 111 になります。実験では、これは通常、未処理または未改変の遺伝子型サンプルになります。ターゲットの相対量のこの値は、実験全体のすべてのサンプルの同じターゲットの値と比較できますが、リファレンスサンプルではすべてのターゲットの値が 1 であるため、異なるターゲット間では比較できません。したがって、正規化の追加レベルにより、実験全体での単一のターゲットの変化のより堅牢な推定が可能になりますが、同じサンプル内であっても異なるターゲットの相対量について推論を行うことはできません。

相対定量を行う場合は、次の手順を実行する必要があります。

１．各生物学的サンプルのすべてのターゲットについて、反応効率とすべての技術的複製 Cq の平均を計算します。これらの平均値は、以降のすべてのステップで使用します。

２．各生物学的複製におけるすべてのリファレンス遺伝子の平均 Cq を計算し、リファレンス遺伝子 Cq として使用します。これを使用して、式（１） に従ってそのサンプル内のすべてのターゲット遺伝子の ΔCq を計算できます。

３．すべての生物学的サンプル中の各ターゲットの正規化された相対発現は、式（２）に従って計算することができます。

４．ΔCq 発現値については、所定の実験的処理について、すべての生物学的複製の正規化された発現値の平均を計算します。この値は、その処理におけるターゲット遺伝子の正規化発現レベルの平均です。

５．ΔΔCq 法を使用する場合は、各テスト サンプルについて式（１）からΔCq 値を計算します。コントロール条件におけるすべての生物学的複製の平均を計算します。

６．コントロール条件のこの平均相対発現を使用して、式（３）に従ってすべての生物学的複製の ΔΔCq 値を計算することにより、すべての試験条件における発現を正規化します。

７．式（５）を用いて、コントロールサンプルの平均値と比較した変化率を計算します。また、コントロール処理における各生物学的複製の倍率変化を計算して、個々のコントロールサンプルの発現を取得します。すべてのコントロール サンプルの発現は 1 に近い必要があります。すべての生体サンプルの発現変化倍数値を Log₂ 変換して、標準偏差、標準誤差、信頼区間を計算し、統計分析を実行します。

選択した定量化方法に関係なく、統計分析方法は実験の実行後ではなく、実験のセットアップ中に決定する必要があります。実験での十分な再現性を確保するために、この段階で統計的検出力テストも実行する必要があります。そうすることで、結果として得られる結論は意味があり、実際の生物学的事象を代表するものになります。統計分析を行う前に、対数変換された発現データに対して正規性テストと歪度テストを実行して、データが正規分布していることを確認する必要があります。対数変換後もデータが正規分布していない場合は、ノンパラメトリック検定を検討してください。適切な統計検定と検定要件に関する詳細は、統計学または生物学者向け統計学の教科書、またはウェブサイトを参照してください。

実験を行う前に、査読付きジャーナルにqPCRデータを掲載するために必要な最小限の実験情報量を把握することが重要です。定量的リアルタイムPCR実験（MIQE）の掲載に必要な最小限の情報を提供するためのガイドラインが公開されており、科学界で広く受け入れられています^１２。必須ではありませんが、掲載するかどうかに関わらず、これらのガイドラインに従うことをお勧めします。これにより、結果の再現性が向上し、データの質が向上し、標準化によって他の研究者に実験内容を明確に伝えることができます。MIQE基準のチェックリストは、以下をご覧ください。

qPCR のアプリケーションには、DNA 分子やさまざまな種類の RNA の定量化が含まれます。以下に、最も一般的な手法をまとめます。

qPCR のこのバリアントは、RNA 分子の定量化に焦点を当てています。PCR は二本鎖 DNA テンプレートで機能するため、RNA 分子を定量化するには、まず DNA に変換する必要があります。これは、逆転写酵素または RTase と呼ばれる酵素を使用して実現され、RNA テンプレートから一本鎖相補 DNA (cDNA) を組み立てることができます。これは逆転写として知られており、qPCR と組み合わせると、逆転写 qPCR または RT-qPCR になります。従来、RT-qPCR は 2 つの手順で完了します。最初の手順では RNA が cDNA に変換され、2 番目の手順では準備された cDNA が qPCR でテンプレートとして使用されます。これにより、RNA サンプルを効率的に使用できます。通常、精製された RNA の一部のみが cDNA 合成に使用され、cDNA 調製物は複数の qPCR で複数の異なるターゲットを検出したり、転写クローニングやライブラリ構築などの他のアプリケーションに使用したりできます。

逆転写酵素が機能するには、DNAポリメラーゼのようなプライマーが必要です。一般的には、3種類のプライマー、あるいはそれらの組み合わせが使用されます。

オリゴ(dT)プライマー

オリゴ(dT)プライマーは、チミジン残基のみからなる短いオリゴヌクレオチド（15～20ヌクレオチド長）であり、ポリA含有RNA分子すべてに無差別に結合します。オリゴ(dT)プライマーのみを使用すると、通常、3’末端に富むcDNAが得られます。これは、真核生物のmRNAの3’末端にはポリA配列が存在し、第一鎖cDNAの合成効率はターゲットRNAの長さに比例して低下するためです。原核生物のRNAはポリA化されていないため、これらのプライマーは原核生物のcDNA合成には適していません。

ランダムヘキサマープライマー

ランダムヘキサマープライマーは、ランダムなヌクレオチド残基を含む6ヌクレオチドまたはその倍数からなるオリゴマーです。これらのプライマーは、十分な相補性であらゆるRNA分子に結合しますが、完全に相補的なプライマーに比べると効率は低くなります。

遺伝子特異的プライマー

遺伝子特異的プライマーは 1 つの特定の配列をターゲットとするため、ターゲット分子のみの効率的な cDNA 合成が可能になります。これは必然的に、cDNA がこの 1 つのターゲットの増幅にのみ適していることを意味します。

1ステップRT-qPCRでは、RNAサンプルとターゲット特異的プライマーを、逆転写酵素とDNAポリメラーゼの両方を含むqPCRミックスに加えます。したがって、ファーストストランド cDNA 合成と qPCR は、単一の組み合わせたサイクリング プログラムで実行されます。

このアプローチでは、反応ミックスにプライマーが含まれたターゲットのみがcDNAに変換され、増幅されます。これにより、サンプル処理のステップ数と実験時間は削減されますが、サンプル使用の柔軟性は犠牲になります。しかし、適切な反応効率の計算を行わずに誤って使用すると、特定のプライマーセットを用いた逆転写反応の効率がqPCRの増幅効率と異なる場合があり、ターゲット定量において実験誤差が生じやすくなります。このようなプライマー特異的なcDNA合成バイアスは、サンプル内のすべてのRNA分子を無差別にプライミングするランダムヘキサマーをミックスしたオリゴdTプライマーを使用する2ステップRT-qPCRではそれほど問題になりません。

逆に、ターゲット特異的プライマーの使用は、低濃度ターゲットの増幅に有利に働き、プロセス全体の感度を高める可能性があります。1ステップRT-qPCRは確かに大きな利点があり、研究ワークフローを大幅に向上させることができます。1ステップRT-qPCRと2ステップRT-qPCRのどちらを選択するかは、調査対象となるターゲットの数と種類、そして同じサンプルがどのような用途に使用される可能性があるかによって異なります。

RT-qPCRの主な用途の一つは、遺伝子発現解析です。この手法では、特定の生物、組織、または細胞種において、特定の遺伝子によって生成される転写分子（mRNA）の数を定量化できます。多くの場合、遺伝子発現は、1つまたは複数のハウスキーピング遺伝子をリファレンス分子として用いたRT-qPCRによる相対定量によって評価されます。次に、リファレンス分子に標準化した後、異なる実験条件間でターゲット遺伝子の発現を比較するように実験が設定されます。この正規化と相対定量は、通常、デルタCq（ΔCq）法またはデルタデルタCq（ΔΔCq）法のいずれかを用いて行われます。前述のように、これらの手法はどちらもqPCRを用いてリファレンス遺伝子とターゲット遺伝子のCq値を取得し、色素ベースおよびプローブベースの検出と互換性があります。

qPCRによる相対定量において重要な要素は、生物と実験に適したリファレンス遺伝子の選択です。複数の査読済み論文は、1つのリファレンス遺伝子への依存はリスクを伴い、遺伝子発現に関する誤った結論につながる可能性があることを示唆しています。これは、あらゆる実験条件下で一定レベルを維持する遺伝子の転写産物は存在しないためです。これには、いわゆるハウスキーピング遺伝子も含まれます。ハウスキーピング遺伝子は、転写産物を一定レベルまたはそれに近いレベルに維持するものの、様々な実験条件下では大きく変動します。この問題を回避するには、正規化に2つ以上のリファレンス遺伝子を使用することが推奨されます。これらの遺伝子は、qPCR実験で使用されるすべての条件下で安定的に発現していることが検証されている必要があります。検証は、公開データ、対象生物に固有の無料でアクセス可能なトランスクリプトームデータベース、あるいはリファレンス遺伝子の絶対定量のためのqPCR実験、あるいはリファレンス遺伝子のCqと反応における総入力RNA量との間に強い相関関係を確立することなどに基づいて行うことができます。

遺伝子発現解析にどの計算方法を選択するかに関係なく、サンプルとリファレンス遺伝子がソフトウェアに正しく入力されていれば、ほとんどの市販ソフトウェア パッケージとオンラインの多くのオープンソース パッケージでこれらの解析が自動的に実行されます。

qPCRは、生物のゲノムDNA中の様々なアレルの存在量を定量化するため、あるいは複数の生物を含む粗生物学的サンプル中の様々な種特異的遺伝子を定量化するためにも日常的に用いられています。後者は、同一サンプル中の種特異的遺伝子の代替としてしばしば用いられます。このような分析では、サンプルの種類や研究間で比較可能な情報を提供するため、通常は絶対定量が選択されます。ただし、サンプル質量、細胞数、または反応における総DNA入力量で正規化することにより、相対定量を用いることも可能です^１２。種特異的遺伝子の研究では、評価対象となる各株または種に特異的な1つ以上の遺伝子がターゲットとして選択されます。多くの場合、これらはそれぞれ原核生物および真核生物の16S rRNAまたは18S rRNAをコードする遺伝子、あるいは小rRNAサブユニット遺伝子と大rRNAサブユニット遺伝子の間に介在する内部転写配列（ITS）です。計画されている研究に応じて、異なるターゲットを選択することもできます。

ターゲットに関係なく、選択されたターゲット遺伝子の標準曲線を使用して、セクション5.1の 「絶対定量化」 で説明されているように絶対定量実験を実行します。標準曲線のターゲットサンプル希釈率は、ターゲットの生物学的に関連するレベルの範囲全体をカバーするように選択する必要があります。サンプル入力値も慎重に測定し、測定された絶対量を正規化するために使用する必要があります。これは、相対定量法とは異なり、サンプル間の取り扱いエラーや精製効率の違いを考慮できる共通の内部コントロールを見つけることがまれであるためです。可能であれば、実験条件全体で存在量が変わらないターゲットを含めることが推奨されます。これは内部増幅コントロールとして機能します。ただし、これは常に可能であるとは限りません。データが正規性検定および歪度検定に合格しない限り、統計解析は、対数変換を行わずに計算された存在量に対して直接実行する必要があります。

qPCRによる絶対定量は、様々な病原体や疾患関連マーカーの同時検出・定量を可能にするため、診断において強力なツールとなります。これにより、患者の診断と治療において計り知れない情報が得られます。診断用qPCRは、通常、特異性を高めるためにプローブベースの定量法を採用しており、求める診断情報に応じてシングルプレックスまたはマルチプレックスで実施できます。診断用PCRでは、絶対量を報告するかどうかに関わらず、適切なネガティブコントロールとともに、常にリファレンスカーブを使用する必要があります。マルチプレックスqPCRは、複数の病原体を並行して同時に検査したり、同じ病原体の異なる配列をターゲットとする複数のプローブを使用できるため、検査の特異性を高めることができるため、特に診断用途に適しています。発表された報告によると、1回のマルチプレックス反応で10種類以上の病原体をスクリーニングできることが示唆されており、このqPCRアプリケーションは非常に強力です^１３。診断用qPCR実験を設定する際には、セクション3.4の「マルチプレックスqPCR設計」の推奨事項に従ってください。

さらに、サンプルをターゲットに対して陽性または陰性として識別するための診断に関連するしきい値を確立するように注意する必要があります。qPCRを診断ツールとして使用する場合、このしきい値は臨床的に検証される必要があります。これには、ターゲットの検出に使用するプライマーと、潜在的な病原体を正確に検出し、非病原性株の類似ターゲットを検出しないというターゲットの適合性の両方の観点から、選択したターゲットに対するqPCRの特異性を確立することが含まれます。さらに、検出限界（LOD）および定量限界（LOQ）は、関連する査読済み文献のガイドラインに従って確立する必要があります。qPCR検査の相対的または定量的な精度も推定する必要があり、方法の精度も確立する必要があります。これらの検査パラメータの設定方法の詳細については、関連する科学文献を参照してください。

プローブベース qPCR のもう 1 つの用途は、ジェノタイピングのためのアレル（対立遺伝子）識別です。このプローブベース検出の特定の用途では、スペクトル的に異なる蛍光体を持つプローブを使用してマルチプレックス反応で特定のアレルをターゲットにすることで、異なる遺伝子型を識別できます。結果として得られる蛍光信号出力により、特定のサンプルにどのアレルが存在するかを識別することができます。このアプローチは、各アレルの量が計算されるのではなく、各プローブの信号強度が特定のしきい値を超えた場合に存在または不在として記録されるという点で、通常、定量的ではありません (ただし、同じ qPCR 実験からそのような情報も抽出できます)。したがって、結果は各アレルについて定性的で 2 値 (存在/不在) になります。1 つのサンプルの各アレルのデータを組み合わせることで、遺伝子型を確立できます (図 １０)。

たとえば、アレル A および B を持つ単一遺伝子座の単純な2アレル状態では、アレル A に特異的なプローブとアレル B に特異的なプローブの 2 つのプローブが設計され、それぞれに異なる蛍光色素がタグ付けされます。これらは、アレル A がホモ接合である個体の固有のプローブ シグナル、アレル B がホモ接合の個体の別個の固有のプローブ シグナル、およびアレル A と B の両方を保有するヘテロ接合個体からの両方のプローブからの混合シグナルを生成します。

HRM曲線解析は、インターカレーション色素を用いたqPCRの威力を活用し、温度変化の増分をより細かく制御できる改良型サーモサイクリング装置と組み合わせることで、融解曲線解析を実行します。qPCR後の標準的な融解曲線解析では、蛍光データは0.2～0.5℃ごとに取得されますが、HRM解析では0.1℃ごとにデータを取得するというはるかに高密度なデータを取得するため、得られる融解曲線の分解能が大幅に向上します。これにより、単一の点変異（SNP）に至るまで、配列のわずかな差異でさえも、融解曲線のシフトとして記録されます。したがって、HRMは、SNP検出、アレル識別、またはターゲットバリアント検出において、プローブベースの検出法に代わる、より安価で効果的な代替手段となります。このアプローチの欠点は、融解曲線のシフトがqPCRアーティファクトの結果である可能性もあるため、特異性が低下することです（セクション2.2の「融解曲線解析の限界」で説明）。HRM解析で得られた結果は、慎重に検証する必要があります（図１１）。

PCR Biosystems 社のqPCR製品または製品サンプルを初めてご使用になる際は、必ずこれらのテストを実施することをお勧めします。これらの推奨事項に従うことで、qPCRデータの信頼性が確保されます。

PCR Biosystems 社のqPCRミックスは、合計8種類のバリエーションをご用意しています。2種類の基本ミックス（レギュラーミックスとブルーミックス）があり、それぞれLo-ROX、Hi-ROX、No-ROX、またはフルオレセイン入りのミックスをご用意しています（表３上）。これらのミックスはすべて性能面で同等であり、使用するqPCR機器のパッシブリファレンス色素要件に応じて選択する必要があります。PCR Biosystems 社のプローブミックスも様々な種類のROXが含まれており、ブルー色素の有無を選択できます（表３下）。ご使用の機器に適したミックスが不明な場合は、qPCR選択ツールを使用して互換性のあるミックスを見つけるか、お問い合わせください。下記の推奨ガイドラインに関しては、これらのミックス間で区別はありません。

実験の準備や、PCR Biosystems 社のミックスと競合他社製品との比較を行う際は、反応の準備に使用するプライマー、プローブ、テンプレート、希釈液、その他の添加剤はすべて、同一バッチ、できれば同一ボトルのものを使用してください。すべての反応は同じ日に、できれば同じ人が準備する必要があります。すべての比較には、同一の装置、および可能であればリキッドハンドリングロボットを使用してください。

絶対感度をミックス間で比較する場合は、ゲノム DNA を使用する必要があります。ただし、テンプレートの希釈率が低いと確率的効果が優先されるため、結果を拡大解釈しないように注意する必要があります。このようなシナリオへの対処方法については、セクション9「トラブルシューティング」で説明します。

テスト実験は次のようにセットアップする必要があります。

• テストサンプルには、4 ～ 5 段階のテンプレート希釈度とテンプレートなしのコントロール (NTC) を含める必要があります。
• 逆転写反応を qPCR とは独立して実行する場合、つまり 1 ステップ qPCR 製品を使用しない場合は、真のサンプルと、通常のサンプルから逆転写酵素を除いたものと同じ試薬をすべて含む逆転写なしコントロールも含める必要があります。
• また、テスト サンプルとコントロール サンプルごとに 3 ～ 4 回の技術的複製を使用する必要があります。
• テンプレート希釈度は、広範囲をカバーし、すべてが標準曲線に寄与できるように選択する必要があります (標準曲線は少なくとも 4 つのポイントで構成されている必要があります)。
• 各反応液量は使用する支持体の量に比例する必要があり（例：96ウェルプレートの場合は少なくとも20μL）、プレート／チューブはセットアップ中ずっと4℃に保たれます。マスターミックスも同様に保管するのが理想的です（ただし、すべてのポリメラーゼはホットスタートであるため、室温でセットアップすることも可能です）。

以下の表は、当社製品をテストする際に使用すべき推奨テスト サンプルとコントロール サンプルをまとめたものです。

あらゆる種類のコンタミネーションを避けるよう注意が必要です。特に、高濃度のターゲットテンプレートを含むサンプルは、NTC反応を汚染することが多いため、注意が必要です。プレートのセットアップには、クリーンベンチまたは専用のqPCRスペースを使用してください。PCRプレートは適切に密封し、各ウェルを完全に密封し、マイクロプレート遠心分離機でスピンダウンして気泡をすべて除去してください。

比較を実行する前に、各メーカーのガイドラインに従ってサイクリング条件を最適化し、すべてのミックスが特定のテンプレートとプライマーのセットに対して最高の性能を発揮できるようにする必要があります。

最適化されたサイクリング条件がミックス間で異なる場合は、各ミックスをその最適な条件だけでなく、他の競合他社の条件でも実行することをお勧めします。

別々に実行する場合は、同じサイクル数を使用する必要があります。

各実行の後には、同一の溶融解析を行う必要があります。

プレートが適切に密閉されていること、および反応ミックスの蒸発がないことを確認するために、各実行後にプレートを検査する必要があります。

偽のシグナル、または反応特異性の低下を示すすべてのウェルは分析から除外する必要があります。

異なるサプライヤーのミックス間で蛍光強度レベルに差があっても、それが同程度であれば、十分な根拠がない限り、それほど重要ではありません。qPCRミックスに固有のダイナミックレンジは、このような差を説明するのに十分すぎるほどです。

異なるミックスを直接比較すると、Cq しきい値推定方法に問題が生じます。異なるミックスの蛍光レベルが異なるため、しきい値法では蛍光レベルの高いミックスの Cq 値が過小評価される可能性があります。これは、シグナルの正規化（基本的にすべてのプラトーを一致させる）によって軽減できます。生のシグナルと出力を比較して、ソフトウェアがデフォルトでこのような正規化を実行するかどうかを確認してください。ソフトウェアがカーブフィッティングから Cq パラメーターを抽出して Cq を推定できる場合、またはデータをエクスポートしてカスタムメイドの分析を実行できる場合は、蛍光レベルの違いによって生じる Cq 値間の誤った差異が修正されます。それ以外の場合は、LinRegPCR などのソフトウェアを使用して視覚化し、可能な場合は Cq 閾値を移動することで Cq 値を割り当てることができます^１０。

各希釈系列について標準曲線を計算する必要があります。曲線の傾き（効率）と切片から、PCR増幅の品質に関する情報が得られます。効率が2（または100%）が理想的で、これは各サイクル間でDNA量が2倍になることを意味します。これより高い効率は、セットアップのエラーまたはサンプル内の阻害物質の存在を示している可能性があります。効率が低い場合は、反応条件が最適ではないことを示唆しています。たとえば、バッファーが間違っている、プライマー設計が間違っている、dNTP、Mg²⁺、酵素の量が間違っている、またはいずれかの成分が分解されているなどです。切片はアッセイの感度の尺度となります。値が低いほど、感度が高くなります。ただし、これは相対的な尺度であり、同じ反応セットアップ（同じアンプリコン、同じサイクリング条件、同じ機器）を比較する場合にのみ使用する必要があります。反応が異なる効率で実行される可能性があるため、異なるサプライヤーのミックスで生成されたCq値を単一のテンプレート希釈度で比較することはお勧めしません。

融解曲線を解析し、プライマーダイマーの存在を確認する必要があります。PCR産物よりも低い温度で融解ピークが見られる場合、プライマーダイマーが形成されていることを示しています。これは特に低温希釈で顕著であり、ホットスタート活性が低いことを示しています。複数のピ​​ークは、プライマー設計の不備、または効率の悪いホットスタート手法による非特異的プライミングに起因する可能性があります。PCR産物よりも高いピークは、ゲノムコンタミネーションを示唆している可能性があります。ピークの絶対的な位置は、バッファー組成の違いにより、ミックスメーカー間で異なる場合が多く、懸念事項ではありません。

qPCRでよく発生する問題は、以下に記載されています。個々の実験条件や明らかな取り扱いミス（例：試薬の添加忘れ、サンプルおよび試薬の不適切な取り扱い・保管）に起因するエラーの原因は、以下には記載されていません。

一般的に、適切な実験設計、プライマーおよびプローブのバリデーション、慎重なサンプル調製、適切なポジティブコントロールおよびネガティブコントロールの使用は、問題を予防し、エラーの原因を特定するのに役立ちます。機器の性能とは関係のない問題が継続的に発生する場合は、試薬サプライヤーにお問い合わせください。PCR Biosystems 社の試薬についてはお問い合わせください。

ターゲットを含むはずの実験サンプルではターゲットが失敗し (増幅されない)、ポジティブコントロール サンプルでは正しく増幅されます

原因１：サンプル中にターゲットが存在しない、または非常に少ない

追加のサンプルが利用できる場合は、抽出を繰り返します。

蒸発によりサンプルを濃縮し、再懸濁します。

エタノール沈殿と再懸濁も選択肢ですが、サンプルの損失が増加します。

原因２：非効率的なcDNA合成

適切な量の高品質のインプット RNA を使用し、cDNA 合成メーカーのガイドラインに従って cDNA 合成を繰り返します。

ターゲット特異的プライマーなど、逆転写プライマーの別の組み合わせを使用してみてください。

RNA の品質が疑わしい場合は、RNA 抽出を繰り返し、RNA の完全性を確認します。

原因３：マスターミックスまたはテンプレート入力時のピペッティングエラー

テンプレートと他のすべてのコンポーネントがすべての反応ウェルに正しく添加されていることを確認しながら実験を繰り返します。

ポジティブコントロールサンプルを含む、ターゲットを含むはずのサンプルにおけるターゲットの失敗（増幅なし）

原因１：プライマーの設計が不適切

プライマーを再設計し、すべてのプライマー設計ガイドラインに従っていることを確認します。

原因２：プライマーのアニーリング条件が厳しすぎる

選択したアニーリング温度を下げ、プライマー検証中に温度勾配を実行していない場合は、プライマー/プローブ セットの最適な Tm を確立します。

原因３：マスターミックスの設定またはテンプレートの入力にエラーがあります

テンプレートと他のすべてのコンポーネントがすべての反応ウェルに正しく添加されていることを確認しながら実験を繰り返します。

原因４：qPCR酵素ミックスの問題

すべての試薬が適切に機能していることを確認するために、ポジティブ コントロール サンプルに対して反応を含めるか個別に実行します。

別のアリコートを試すか、新しいバッチの qPCR ミックスを注文します。

テンプレートコントロールのない生成物

原因１：ピペッティングエラー、プレートセットアップ時のテンプレート入力が不正確

テンプレートと他のすべてのコンポーネントがすべての反応ウェルに正しく添加されていることを確認しながら実験を繰り返します。

原因２：マスターミックスや試薬が汚染されている

qPCR 酵素ミックスとプライマー希釈液の新しいアリコートを使用して実験を繰り返します。

原因３：実験台が汚い

実験台を掃除するか、研究室の専用 PCR セットアップエリアを使用するか、クリーンベンチを使用してください。

原因４：汚染されたピペット

ピペットを分解して洗浄し、オートクレーブ処理します（ピペットがオートクレーブ処理可能かどうかは製造元に確認してください）。

qPCR プレートのセットアップ、プライマーとサンプルの希釈、およびマスターミックスの調製にはフィルターチップを使用します。

サンプルとポジティブコントロールの蛍光が低い

原因１：マスターミックスに阻害剤が存在すると、増幅と最終収量が減少します

サンプルを再精製し、吸光度 (A₂₆₀/A₂₈₀、A₂₆₀/A₂₃₀) をチェックして純度を確認します。

原因２：試薬の光退色、または凍結融解サイクルの繰り返し

試薬が使用期限内であることを確認し、直射日光を避け、到着時に 1 回の調製ですべて使用される量のアリコートを混合してください。

線形増幅プロットは、しきい値を超えて上昇しますが、反応が終了するまで線形を維持します

原因：qPCR の効率の低下または阻害を示しています

ピペッティングが正確であることを確認しながら反応を繰り返します。

ある程度の核酸の損失が予想されますが、フェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿、またはカラムベースの精製を使用してサンプルをさらに精製してみてください。
問題が解決しない場合は、サンプルから核酸を再抽出するか、サンプルを同等のものと交換してください。

他のサンプルと比較してはるかに低い蛍光レベルでプラトーとなるシグモイド増幅プロット

原因１：反応中の成分によって蛍光が消光されています

解決策については前の項目を参照してください。

原因２：インプットテンプレートが多すぎる

使用するテンプレートを減らしてください。

同じ生物学的サンプルの技術的複製間のばらつきが大きい

原因１：ターゲットの存在量が少ないため、確率的な初期増幅が発生する

サンプルの核酸濃度と完全性をチェックする。

1 回の反応あたりにより多くのサンプルを使用します。

テンプレート抽出を繰り返すと、より高い核酸濃度が得られます。

蒸発（スピード真空）またはエタノール沈殿によりサンプルを濃縮し、より少量で再懸濁します。

原因２：インプットテンプレートが多すぎる

使用するテンプレートを減らしてください。

同じ生物学的サンプルの技術的複製間のばらつきが大きい：同じ実験処理内での生物学的複製間のばらつきが大きい

原因１：ピペッティングエラー

問題のあるサンプルが適切にセットアップされていることを確認しながら実験を繰り返します。

可能な場合はリキッド ハンドリング ロボットを使用する。

原因２：粒子状物質（残留組織、不適切に溶解した試薬、汚染物質）の存在による不均質なサンプル

適切に調製した溶液を使用して、遠心分離またはエタノール沈殿によりサンプルの抽出または精製を繰り返す。

原因３：テンプレート量の自然な変動を反映している可能性があります

実験計画中に統計的検出力テストを実行して、このようなばらつきを克服するのに十分な複製があることを確認します。

同じ生物学的サンプルの技術的複製間のばらつきが大きい：増幅の遅延、Cq の遅延

原因１：テンプレート調製のばらつきが大きく、抽出/精製収率やcDNA合成効率が異なる

核酸精製には、同様の量の開始サンプル (組織質量、細胞数、体液の量など) を使用します。

抽出中にサンプルを徹底的に均質化するようにしてください。サンプルの均質化が不十分だと、最終的な核酸収量が減少します。

cDNA をテンプレートとして使用する場合は、すべてのサンプルの逆転写が効率的であることを確認してください。関連するトラブルシューティングの項目を参照してください。

原因２：入力テンプレート濃度のばらつきが大きい

すべての生体サンプルが同様の総テンプレート濃度、理想的には反応の線形ダイナミック レンジの中間点近くまで希釈されていることを確認します。

すべての生物学的サンプルに同量のテンプレートを使用する。

原因３：ターゲット存在量が少ない

入力核酸がアプリケーションの推奨範囲内であることを確認してください。

原因 1 で推奨されているステップに従って、ターゲットの存在量を増やします。

増幅の遅延、Cq の遅延：シフトした融解曲線

原因１：反応条件が非効率

ポジティブコントロールサンプルを使用して実験設定を検証し、プライマー濃度と反応条件を変えてみます。

プライマーを再設計します。

可能であれば、代替のターゲット領域を選択します。たとえば、アンプリコンの長さを 80 ～ 100 bp に短縮します。

原因２：非効率的なcDNA合成

上記を参照してください。

原因３：ターゲット内の SNP はサンプル全体のアニーリングに大きく影響します

電気泳動またはシーケンスによって正しい産物が増幅されていることを確認します。

SNP バリアントを解析に含めない場合は、バリアントを区別するためにプライマー/プローブを再設計します。

シフトした融解曲線：融解曲線におけるリーディングピークまたはダブルピーク

原因１：非特異的な増幅

サンプルの精製を繰り返して、汚染がないことを確認します。

プライマー/プローブ配列の特異性を確認します。

プライマー/プローブを異なるターゲット領域に合わせて再設計します。

原因２：サンプル中の汚染物質によりアニーリング温度が変化する

アガロースゲル電気泳動を実行して正しいアンプリコン長を確認します。不明な場合は、制限酵素消化を行うか、産物の配列を解析してください。

融解曲線がシフトした同じ生成物であることが確認された場合は、分析を続行します。

原因３：複数の生成物が存在する

反応ストリンジェンシーを上げ、アニーリング温度を上げ、アニーリング時間を短縮します。

サイクルの合計数を減らします。

インシリコでプライマーの特異性を確認し、必要に応じてプライマーを再設計します。

融解曲線におけるリーディングピークまたはダブルピーク

原因１：プライマーダイマーまたはヘアピンが存在する
(強度が低い初期のピークや先行ピークは、プライマーの二次構造を示すことが多いです)

アニーリング温度を上げます。

まだ実行していない場合は、温度勾配を実行して最適なアニーリング条件を特定します。

プライマー濃度を下げます。

プライマーとプローブを再設計してください。

原因２：二相性変性産物（例：哺乳類CFTR遺伝子）

ゲル電気泳動とシークエンシングにより単一産物であることを確認します。正しい産物である場合は、二重ピークを無視し、通常通り分析を進めます。

ターゲットを含むはずの実験サンプルではターゲットが失敗し (増幅されない)、ポジティブコントロール サンプルでは正しく増幅されます

原因１：サンプル中にターゲットが存在しない、または非常に少ない

追加のサンプルが利用できる場合は、抽出を繰り返します。

蒸発によりサンプルを濃縮し、再懸濁します。

エタノール沈殿と再懸濁も選択肢ですが、サンプルの損失が増加します。

原因２：非効率的なcDNA合成

適切な量の高品質のインプット RNA を使用し、cDNA 合成メーカーのガイドラインに従って cDNA 合成を繰り返します。

ターゲット特異的プライマーなど、逆転写プライマーの別の組み合わせを使用してみてください。

RNA の品質が疑わしい場合は、RNA 抽出を繰り返し、RNA の完全性を確認します。

原因３：マスターミックスまたはテンプレート入力時のピペッティングエラー

テンプレートと他のすべてのコンポーネントがすべての反応ウェルに正しく添加されていることを確認しながら実験を繰り返します。

ポジティブコントロールサンプルを含む、ターゲットを含むはずのサンプルにおけるターゲットの失敗（増幅なし）

原因１：プライマーの設計が不適切

プライマーを再設計し、すべてのプライマー設計ガイドラインに従っていることを確認します。

原因２：プライマーのアニーリング条件が厳しすぎる

選択したアニーリング温度を下げ、プライマー検証中に温度勾配を実行していない場合は、プライマー/プローブ セットの最適な Tm を確立します。

原因３：マスターミックスの設定またはテンプレートの入力にエラーがあります

テンプレートと他のすべてのコンポーネントがすべての反応ウェルに正しく添加されていることを確認しながら実験を繰り返します。

原因４：qPCR酵素ミックスの問題

すべての試薬が適切に機能していることを確認するために、ポジティブ コントロール サンプルに対して反応を含めるか個別に実行します。

別のアリコートを試すか、新しいバッチの qPCR ミックスを注文します。

テンプレートコントロールのない生成物

原因１：ピペッティングエラー、プレートセットアップ時のテンプレート入力が不正確

テンプレートと他のすべてのコンポーネントがすべての反応ウェルに正しく添加されていることを確認しながら実験を繰り返します。

原因２：マスターミックスや試薬が汚染されている

qPCR 酵素ミックスとプライマー希釈液の新しいアリコートを使用して実験を繰り返します。

原因３：実験台が汚い

実験台を掃除するか、研究室の専用 PCR セットアップエリアを使用するか、クリーンベンチを使用してください。

原因４：汚染されたピペット

ピペットを分解して洗浄し、オートクレーブ処理します（ピペットがオートクレーブ処理可能かどうかは製造元に確認してください）。

qPCR プレートのセットアップ、プライマーとサンプルの希釈、およびマスターミックスの調製にはフィルターチップを使用します。

サンプルとポジティブコントロールの蛍光が低い

原因１：マスターミックスに阻害剤が存在すると、増幅と最終収量が減少します

サンプルを再精製し、吸光度 (A₂₆₀/A₂₈₀、A₂₆₀/A₂₃₀) をチェックして純度を確認します。

原因２：不適切な保管によりプローブ上の蛍光色素が光退色した

プローブの新しい希釈液を使用するか、プローブストック溶液に問題がある場合は新しいバッチを注文してください。

蛍光のバックグラウンドが高い

原因１：プローブの劣化

ターゲットが存在しない場合に NTC で蛍光が増加する可能性があるかどうかを確認します。

原因２：クエンチャーノイズ

一部のクエンチャー（例：TAMRA）も蛍光を発する場合があります。理想的には、暗い色のクエンチャーを使用し、内部クエンチャーを添加することをお勧めします。

原因３：高濃度のインプット DNA

テンプレート、プライマー、およびプローブの入力量を、効率的な増幅を可能にする最小限の量まで減らします。

原因４：プレートの不適切な取り扱い
（例：気泡、指紋の汚れ、プレート/ストリップキャップ/シーリングフィルムの汚れ）

プレート遠心分離によりウェル内に気泡が存在しないことを確認してください。

手袋をせずにストリップ キャップやシーリング ステッカーに触れないでください。理想的には、ウェルの上部や下部ではなく、端からプレートを持ちます。

線形増幅プロットは、しきい値を超えて上昇しますが、反応が終了するまで線形を維持します

原因：qPCR の効率の低下または阻害を示しています

ピペッティングが正確であることを確認しながら反応を繰り返します。

ある程度の核酸の損失が予想されますが、フェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿、またはカラムベースの精製を使用してサンプルをさらに精製してみてください。
問題が解決しない場合は、サンプルから核酸を再抽出するか、サンプルを同等のものと交換してください。

他のサンプルと比較してはるかに低い蛍光レベルでプラトーとなるシグモイド増幅プロット

原因：反応中の成分によって蛍光が消光されています

解決策については前の項目を参照してください。

同じ生物学的サンプルの技術的複製間のばらつきが大きい

原因１：ターゲットの存在量が少ないため、確率的な初期増幅が発生する

サンプルの核酸濃度と完全性をチェックする。

1 回の反応あたりにより多くのサンプルを使用します。

テンプレート抽出を繰り返すと、より高い核酸濃度が得られます。

蒸発（スピード真空）またはエタノール沈殿によりサンプルを濃縮し、より少量で再懸濁します。

原因２：ピペッティングエラー

問題のあるサンプルが適切にセットアップされていることを確認しながら、実験を繰り返します。

可能な場合はリキッド ハンドリング ロボットを使用する

原因３：粒子状物質（残留組織、不適切に溶解した試薬、汚染物質）の存在による不均質なサンプル

適切に調製した溶液を使用して、遠心分離またはエタノール沈殿によりサンプルの抽出または精製を繰り返す。

同じ実験処理内での生物学的複製間のばらつきが大きい

原因１：テンプレート量の自然変動を反映している可能性があります

実験計画中に統計的検出力テストを実行して、このようなばらつきを克服するのに十分な複製があることを確認します。

原因２：テンプレート調製のばらつきが大きく、抽出/精製収率やcDNA合成効率が異なる

核酸精製には、同様の量の開始サンプル (組織質量、細胞数、体液の量など) を使用します。

抽出中にサンプルを徹底的に均質化するようにしてください。サンプルの均質化が不十分だと、最終的な核酸収量が減少します。

cDNA をテンプレートとして使用する場合は、すべてのサンプルの逆転写が効率的であることを確認してください。関連するトラブルシューティングの項目を参照してください。

原因３：入力テンプレート濃度のばらつきが大きい

すべての生体サンプルが同様の総テンプレート濃度、理想的には反応の線形ダイナミック レンジの中間点近くまで希釈されていることを確認します。

すべての生物学的サンプルに同量のテンプレートを使用する。

増幅の遅延、Cq の遅延

原因１：ターゲット存在量が少ない

入力核酸がアプリケーションの推奨範囲内であることを確認してください。

ひとつ前の項目の原因 ２ で推奨されているステップに従って、ターゲットの存在量を増やします。

原因２：プライマーおよびプローブの二次構造は、プライマー/プローブ結合部位に関してテンプレートと競合します

プライマーとプローブの濃度を下げます。

反応効率を損なうことなく、アニーリング温度を可能な限り最大まで上げます。

プライマーとプローブを再設計してください。

原因３：反応条件が非効率

ポジティブコントロールサンプルを使用して実験設定を検証し、プライマー濃度と反応条件を変えてみます。

プライマーを再設計します。

可能であれば、代替のターゲット領域を選択します。たとえば、アンプリコンの長さを 80 ～ 100 bp に短縮します。

原因４：非効率的なcDNA合成

上記を参照してください。

収量が低い

原因１：低インプットRNA

RTase メーカーが推奨する最低量以上の RNA を使用していることを確認してください。

入力 RNA の量を最大推奨量まで増やします。

RNA 調製物が希釈されている場合は、RNA 抽出を繰り返すか、蒸発またはエタノール沈殿と再懸濁によってサンプルを濃縮することを検討してください。

原因２：インプットRNAが多すぎる

RNAの投入量を、RTaseメーカーが推奨する最小量まで減らしてください。必要に応じて、サンプルを希釈してRNA濃度を下げてください。

原因３：RNA テンプレートの品質が低い

RNA の品質が良好であることを確認し、アガロースゲル電気泳動を実行するか、バイオアナライザーで RNA の整合性をチェックします。

必要に応じて、完全性を確認しながら再度精製を繰り返します。

原因４：RNA調製物中の残留DNase活性

使用されている DNase が熱に弱いことを確認してください。

精製中に RNA を処理した後は、DNase の不活化を確実に行ってください。

DNAの汚染

原因１：非差別的な精製方法

従来の溶媒ベースの方法の中には、RNA と DNA をうまく区別できないものがあるため、DNA が豊富な RNA 調製物が生成されます。選択的な沈殿には、LiClなどの適切な塩を使用してください。

TRIzolTM タイプの試薬を使用する場合は、有機溶媒抽出ステップ中に DNA を含む中間相を持ち越さないようにしてください。

カラムベースの RNA 精製キットに切り替えることを検討してください。

カラムベースの RNA 調製キットを使用する場合は、カラム上での消化は効率が悪いことが多いため、カラム上での消化ではなく溶出後の DNase 処理を選択してください。

精製方法に関係なく、必ず DNase 処理手順を実行し、PCR によってその成功を検証します。

原因２：DNase 処理の失敗

カラムベースの RNA 調製キットを使用する場合は、カラム上での消化は効率が悪いことが多いため、カラム上での消化ではなく溶出後の DNase 処理を選択してください。

DNase 反応で推奨される RNA の最大量を超えないようにしてください。この量は、ほとんどのDNaseメーカーによって指定されています。

DNase が活性であることを再確認するか、新しいアリコートを使用して、より長い DNase 処理を実行します。

原因３：DNase処理をしなかった

精製方法に関係なく、必ず DNase 処理手順を実行し、PCR によってその成功を検証します。

原因４：汚染された設備

機器や消耗品、特にピペットチップやサンプルチューブに核酸が含まれていないことを確認してください。

作業エリアを清掃し、PCR 関連手順専用の作業スペースを使用してください。

過剰な短い cDNA フラグメント

原因１：RNA テンプレートの品質が低い

RNA の品質が良好であることを確認し、アガロースゲル電気泳動を実行するか、バイオアナライザーで RNA の整合性をチェックします。

必要に応じて、完全性を確認しながら再度精製を繰り返します。

原因２：オリゴdTプライマーのみ、またはランダムヘキサマープライマーのみを使用

ランダムヘキサマーとオリゴ dT プライマーを組み合わせて使用​​します。

原因３：短いインキュベーション時間

インキュベーション時間を、RTaseメーカーが推奨する最大値まで延長してください。多くのプロトコルでは、ほとんどの用途に適した短い伸長時間が選択されますが、これにより第一鎖cDNAの長さが短くなる可能性があります。

3’末端に富むcDNA、5’末端が不足している

原因１：オリゴdTプライマーのみ使用

完全長の転写産物を確実にカバーするには、ランダム ヘキサマーとオリゴ dT プライマーを組み合わせて使用します。

原因２：短いインキュベーション時間

インキュベーション時間を、RTaseメーカーが推奨する最大値まで延長してください。多くのプロトコルでは、ほとんどの用途に適した短い伸長時間が選択されますが、これにより第一鎖cDNAの長さが短くなる可能性があります。

期待されるトランスクリプトが検出されない

原因１：低インプットRNA

RTase メーカーが推奨する最低量以上の RNA を使用していることを確認してください。

入力 RNA の量を最大推奨量まで増やします。

原因２：RNA テンプレートの品質が低い

RNA の品質が良好であることを確認し、アガロースゲル電気泳動を実行するか、バイオアナライザーで RNA の整合性をチェックします。

必要に応じて、完全性を確認しながら再度精製を繰り返します。

原因３：非効率的なプライミング

テンプレートとプライマーを 65 ～ 70 °C で 5 分間プレインキュベートし、逆転写反応を開始する前に氷上で急速に冷却することにより、テンプレートを完全に変性させます。

可能であれば (転写物クローニングや 1 ステップ RT-qPCR など)、一般的なプライマー (ランダム ヘキサマーやオリゴ (dT) など) の代わりに、第一鎖 cDNA 合成に遺伝子特異的なプライマーを使用します。

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