Prionics AG 社 PrioCHECK™ Toxoplasma Ab ブタELISA キットを⽤いた手動分析作業との比較
はじめに
ELISA プロトコールは、異なる試薬の添加、インキュベーション、マイクロプレート洗浄ステップおよびOD 測定などのルーチンステップを含みます。多くの場合実験台には、アッセイ手順に必要な⼤きな器具あるいは複数の機器が混在しています。スペース不⾜は⽣産性に悪影響を及ぼします。全自動ELISAシステムCrocodile LB925は、標準のスタンドアロンELISAリーダーのサイズで、5 つの個々の機器の機能性を持ち合わせています。このアプリケーションノートでは、ELISA 検査キットPrioCHECK™Toxoplasma Ab ブタ（Prionics AG 社製）を使⽤し、⼿動分析との⽐較を⾏います。
トキソプラズマ症は、サルコシスティダエ科（Sarcocystidae）に属する原⽣動物寄⽣⾍トキソプラズマ・ゴンディイ（Toxoplasma gondii）によって発症します。トキソプラズマ感染は、ヒトおよびその他多くの温⾎動物種に広範に存在します。出現は世界規模でありますが、ヒトおよび動物集団での罹患率は国によって⼤きく異なります。
使用機材
測定システム：全自動ELISAシステム Crocodile LB925
シングルチャンネルピペット (20-200µl)
Tecan HydroFlex™（マニュアルテスト用）
Tecan Sunrise™（マニュアルテスト用）
試薬： PrioCHECK™ Toxoplasma Ab porcine (Prionics AG社)
品番：7610230
ロット番号：TX100401M
使用期限：2011/04/30
消耗品： 脱イオン水、溶液ボトル、ピペット用チップ
方法
テスト手順
陽性サンプルを希釈し、サンプルが陽性として検出される希釈度を評価することによって分析感度を評価しました。分析感度を決定するために、2 つの陽性サンプルを希釈無しから64 倍までの段階希釈を⾏いました。両⽅の段階希釈液全自動ELISAシステム Crocodile LB925を⽤いてそれぞれ３回測定し、並⾏して同様な試料を⼿動で２回測定しました。⼿動作業で処理した試料ではTecan リーダを⽤いて、OD 値を測定しました。
定量原理
図1： ELISA反応の⼿順ステップの概略図。PrionicsからのELISAキットを、キットの説明書に記載されているように実施しました。各ウェルの吸光度を、450nmで測定しました。（620nmでリファレンス測定）
PrioCHECK™ Toxoplasma Ab ブタは、Toxoplasma gondii に対する抗体の検出の間接的ELISA です。この試験は、短い4 ステップELISA プロトコルがあります。試験サンプルをトキソプラズマ抗原で被覆したプレート中で室温でインキュベートします。次いで、プレートを洗浄し、酵素標識抗ブタ抗体を添加します。シグナルが測定され、⾊が発⾊する場合、サンプルは抗トキソプラズマ抗体について陽性です。試薬および試料の希釈は、試験⼿順書に記載されているように⾏いました。最後のページにはCrocodile のアッセイプログラムが掲載されています。
測定結果
検証基準
ポジティブコントロールの平均OD450 は>1,2 である必要があります。
弱ポジティブコントロールの陽性率の平均割合は、35％以上でなければなりません。
ネガティブコントロールの平均OD450 は<0.15となります
陽性率（％）＝（サンプルOD）/（ポジティブコントロールOD）× 100
図2：陽性（PC）、陰性（NC）および弱陽性（wPC）コントロールを2 回測定しました。ODはOD450-620です。図は、測定されたOD450-620値に関連した陽性（PC）、陰性（NC）および弱陽性（wPC）コントロールを示します。
図3：表およびグラフは、Crocodile LB925（3回測定）および手動（2回測定）で測定した2つの異なる希釈系列のOD450-620値の平均結果を示します。
まとめ
全自動ELISAシステム Crocodile LB925で分析したサンプルの平均OD450-620値は、手動で処理したサンプルのOD450-620値と同等でした。PrioCHECK™Toxoplasma Ab ブタを用いた場合、平均OD450が＜0.15の時、陰性と判断されます。全自動ELISAシステム Crocodile LB925は、1：32の時の平均OD450-620値は0.15であり、手動で処理したサンプルでは、この希釈における平均OD450-620値は0.14でした。
結論
アッセイ⼿順に全自動ELISAシステム Crocodile LB925を使⽤することは⾮常に簡単であり、サンプルの添加のみで済みます。このアプリケーションノートでは全自動ELISAシステム Crocodile LB925を使用したPrioCHECK™Toxoplasma Abブタの分析感度は、試験の手動処理による分析感度と同等であることを示しています。
謝辞
本試験に於きまして、試薬供給およびテクニカルサポートを頂きました、Prionics AG 社およびPascal Schacher ⽒、Mario Pürro ⽒、Daniel Zwald ⽒のご協⼒に深く感謝申し上げます。
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※本ページの内容は2011年3月にTitertek Berthold社がリリースしたアプリケーションノートのアーカイブです