PCRBIO Ultra Polymerase は、非常に困難なテンプレートの増幅用に設計されています。

PCRBIO Ultra Polymerase は、阻害剤の存在などの難しい条件下でも、困難で複雑なターゲットを効率的かつ信頼性高く増幅できるように設計された、非常に堅牢な酵素です。この酵素とバッファー システムは、複雑なゲノム DNA や GC 含有量の高いターゲット (最大 80% GC) を含む幅広いテンプレートで優れた PCR パフォーマンスと高い成功率が得られるように開発されました。

PCRBIO Ultra Polymerase は PCR 阻害剤に対する耐性が高く、コロニーおよび粗サンプル PCR に最適です。生成された PCR 産物は A テールで、TA クローニング ベクターにクローニングできます。酵素には、dNTP と MgCl₂ を含む最適化されたバッファーが付属しています。

当社の抗体媒介ホットスタート配合は、プライマーダイマーと非特異的産物の形成を防ぎ、低コピー数のターゲット配列からの特異的かつ高感度な増幅を可能にします。利便性を高めるために、PCRBIO Ultra Polymerase は、プライマーとテンプレートを除くすべての反応成分を含む 2x レディミックスとしてもご利用いただけます。PCRBIO Ultra Mix Red には、アガロースゲル電気泳動中の直接ロードおよび追跡に適した、プリロードされた赤色色素が含まれています。

GAPDH 遺伝子の 0.8kb、1.0kb、1.8kb、2.7kb 断片、RBL15 遺伝子の 4.6kb 断片、MYH6 遺伝子の 5.9kb 断片の増幅。開始テンプレート量はマウスゲノム DNA 20 ng (5.9kb 断片の場合は 50 ng) で、2 ～ 5 倍に希釈されます。PCRBIO Ultra Polymerase は、示された断片長の範囲を高い収量と特異性で増幅します。

20 ng のマウスゲノム DNA をテンプレートとして使用し、67°C ～ 60°C のアニーリング温度範囲で、GC 含有量がそれぞれ 69% と 71% の ATXN2 遺伝子の 0.5kb (P1) と 0.6kb (P2) の断片を増幅しました (B ～ E)。PCRBIO Ultra Polymerase は、GC 含有量が 65% を超える GC リッチ テンプレートを効率的に増幅し、GC 含有量が最大 80% のテンプレートに推奨されます。

PCRBIO Ultra Polymerase は、4°C、25°C、37°C​​ で 14 日後、および 4°C および 25°C で 28 日後でも活性に変化は見られません。

PCRBIO Ultra Polymerase

PCRBIO Ultra Mix

PCRBIO Ultra Mix Red

アッセイに特殊なバッファーが必要な場合、PCRBIO Ultra Polymerase を使用できますか？

PCRBIO Ultra Polymerase に付属する 5x PCRBIO Ultra Buffer は、この酵素専用に開発されたものであり、併用することを強くお勧めします。ただし、PCRBIO Ultra Polymerase は、野生型 Taq で使用するために開発されたあらゆる PCR バッファーと互換性がある必要があります。PCRBIO Ultra Polymerase でカスタマイズしたバッファーを使用する場合は、アニーリング温度や酵素、テンプレート、dNTP、MgCl₂ の濃度などの反応パラメータの最適化が必要になる可能性があることに留意してください。

PCRBIO Ultra Polymerase はコロニー PCR に使用できますか？

はい。細菌コロニーを使用する場合は、滅菌チップを使用してコロニーを選択し、50 µL の PCR 反応液に再懸濁します。液体培養から作業している場合は、最終混合物に 5 µL の一晩培養液を追加します。一般的なプロトコルに従い、最初の変性時間を 95 °C で 10 分に増やします。

PCRBIO Ultra Polymerase は血液サンプルからの DNA の増幅に使用できますか？

はい。2 µL の血液サンプルを 50 µL の PCR 反応に使用し、一般的なプロトコルに従ってください。血液成分が PCR 反応を阻害する可能性があることに注意してください。PCR 増幅に最適なテンプレート濃度を見つけるために、サンプルの連続希釈を実行します。

私の結果には、非特異的なアンプリコンやスメアのバックグラウンドが多く含まれています。トラブルシューティングについて何かアドバイスはありますか？

スメアが懸念される場合は、それが最適ではない条件でアガロースゲル電気泳動を実行したことによるアーティファクトではないことを確認することをお勧めします。最適ではない条件には、高電圧やゲルが固まるのに十分な時間を与えないことが含まれます[1]。

また、PCR 反応のトラブルシューティングを行い、以下の提案を検討する必要がある場合もあります [2]。

• プライマーは、プライマー間の相互作用を防ぎ、特異性を向上させるように設計する必要があります
• アニーリング温度を上げるか、アニーリング温度勾配 PCR を実施して最適なアニーリング温度を決定します
• 反応中のテンプレートの量を減らします。高品質の DNA を得るには、50 µL 反応あたり 1 ～ 100 ng のゲノム DNA または 5 ng 以下のプラスミド / ラムダ DNA を使用します
• サイクル数を減らします
• 反応あたりの酵素量を減らします
• プライマー濃度を下げますが、各プライマーの濃度は 100 nM 以上にしてください
• 最終濃度が 5% ～ 10% になるように反応液に DMSO を含めます

1. Koontz, L. Agarose Gel Electrophoresis. Laboratory methods in enzymology : DNA. First edition. edn, Vol. 529 35-45 (2013).
2. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp, e3998, doi:10.3791/3998 (2012).

私の結果では、収率が非常に低いことがわかりました。トラブルシューティングについて何かアドバイスはありますか？

以下の提案を検討し、文献[1]も参照するとよいでしょう。

• アニーリング温度勾配 PCR におけるアニーリング温度を最適化します
• 反応中のテンプレートの量を増やしてください
• サイクル数を増やしてください
• 反応あたりの酵素の量を増やします
• プライマー濃度を増やしますが、各プライマーの濃度が 1 μM を超えないようにしてください
• 新鮮なdNTP溶液を試してください
• MgCl₂を最適化します

1. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp, e3998, doi:10.3791/3998 (2012).

アガロースゲル上での Red Mix 色素の見かけの Mw はどれくらいですか？

この非阻害性色素は、ゲルへの直接ローディングを可能にするために添加されており、1% アガロースゲルでは 200 ～ 300 bp、2% アガロースゲルでは 50 ～ 100 bp の DNA フラグメントと同様の速度で泳動します。異なるアガロース含有量のゲルを泳動すると、この見かけの分子量に変化が見られる場合があります。

PCRBIO Ultra Polymerase のエラー率はどれくらいですか？

この酵素のエラー率は、取り込まれたヌクレオチド 2.0 x 10⁵ あたり約 1 個のエラーです。

PCRBIO Ultra Polymerase の推奨伸長時間はどれくらいですか？

5kb 未満のアンプリコンの場合、真核生物 DNA からの増幅には 1kb あたり 15 秒を推奨します。より長いアンプリコンの場合は、1kb あたり 40 ～ 60 秒を推奨します。