PCRBIO Taq DNA Polymerase は、ジェノタイピング、スクリーニング、ライブラリ構築など、日常のあらゆる PCR アプリケーションに適した、手頃な価格で多用途かつ強力な酵素です。

PCRBIO Taq DNA Polymerase は、ジェノタイピング、スクリーニング、ライブラリ構築など、日常のあらゆる PCR アプリケーションに適した強力な酵素です。PCRBIO Taq DNA Polymerase は、GC および AT リッチの両方を含む広範囲のテンプレート上で一貫して良好なパフォーマンスを発揮します。

PCRBIO Taq DNA Polymerase は 5′-3′ エキソヌクレアーゼ活性を持っていますが、3′-5′ エキソヌクレアーゼ (校正) 活性は持っていません。この酵素のエラー率は野生型 Taq DNA ポリメラーゼと同じで、組み込まれたヌクレオチド 2.0 x 105 個あたり約 1 つのエラーです。

PCRBIO Taq DNA Polymerase は、市場で最高の速度、収量、特異性、一貫性で増幅できる多用途性を備え、可能な限り最高の水準で機能する手頃な価格のルーチン アプリケーション ポリメラーゼを研究コミュニティに提供します。生成された PCR 製品は A テールで、TA クローニング ベクターにクローニングできます。この酵素は、ホスト DNA の物理的、化学的、酵素的除去を含む強化された 12 段階の精製戦略を使用して生成されます。

さらに利便性を高めるため、PCRBIO Taq DNA Polymerase は、プライマーとテンプレートを除くすべての反応コンポーネントを含むすぐに使用できる 2x ミックスとしてご利用いただけます。PCRBIO Taq Mix Red には、アガロース ゲル電気泳動中に直接ロードして追跡するのに適した赤色染料が含まれています。

マウスゲノム DNA の 10 倍希釈系列 (5000、500、50、5pg) と、PCRBIO Taq DNA ポリメラーゼ (紫) および対応する NEB (オレンジ)、Promega (黄色)、Thermo (赤) を使用した、GAPDH 遺伝子の 1kb フラグメントの PCR 増幅。反応はマスター ミックス形式を使用して設定し、メーカーの推奨事項に従いました。サイクル条件は、95°C 2 分、その後 95°C 15 秒、63°C 15 秒、72°C 30 秒の 40 サイクルでした。反応量の 1/5 を 1% アガロース ゲルにロードしました。L: PCRBIO ラダー II。PCRBIO Taq DNA ポリメラーゼは、NEB の OneTaq および Promega の GoTaq G2 よりも性能が優れており、Thermo の DreamTaq に似ています。

マウスゲノム DNA の 10 倍希釈系列 (5000、500、50、5pg) を使用した GAPDH 遺伝子の 1kb フラグメントの PCR 増幅。PCRBIO Taq Mix Red および対応する Taq ミックス (NEB (オレンジ)、Promega (黄色)、Thermo (赤)、Kapa Biosystems (青)) を使用。反応はメーカーの推奨事項に従ってセットアップしました。サイクル条件は、95°C 2 分、次に 95°C 15 秒、63°C 15 秒、72°C 30 秒を 40 サイクル (NEB の場合: 94°C 2 分、次に 94°C 15 秒、63°C 15 秒、68°C 30 秒を 40 サイクル) でした。L: PCRBIO Ladder II。

開始時のテンプレート量は 5ng のマウスゲノム DNA でした。増幅されたフラグメントは 3 つの異なる遺伝子に属し、GC 含有量に応じて選択されています (GAP800 bp は 49% GC、ATX500 bp は 69% GC、ATX600 bp は 71% GC)。PCRBIO Taq Mix Red (紫) および競合他社の対応する Taq ミックスは、メーカーの推奨に従って使用されました: NEB (オレンジ)、Promega (黄色)、Thermo (赤)、Kapa Biosystems (青)。サイクル条件は、95°C 5 分、その後 95°C 15 秒、60°C 15 秒、72°C 20 秒を 40 サイクルでした。反応容量の 2/5 を 1.2% アガロースゲルにロードしました。L: PCRBIO ラダー III。

PCRBIO Taq DNA Polymerase

PCRBIO Taq Mix

PCRBIO Taq Mix Red

アッセイに特殊なバッファーが必要な場合、PCRBIO Taq DNA Polymerase を使用できますか？

PCRBIO Taq DNA Polymerase に付属する 5x PCRBIO 反応バッファーは、この酵素専用に開発されたもので、併用することを強くお勧めします。ただし、PCRBIO Taq DNA Polymerase は、野生型 Taq 用に開発されたすべての PCR バッファーと互換性があります。PCRBIO Taq DNA Polymerase でカスタマイズされたバッファーを使用する場合は、アニーリング温度や酵素、テンプレート、dNTP、MgCl₂ の濃度などの反応パラメーターの最適化が必要になる場合があることに注意してください。

PCRBIO Taq DNA Polymerase はコロニー PCR に使用できますか？

はい。細菌コロニーを使用する場合は、滅菌チップを使用してコロニーを選択し、50 µL の PCR 反応液に再懸濁します。液体培養から作業している場合は、最終混合物に 5 µL の一晩培養液を追加します。一般的なプロトコルに従い、最初の変性時間を 95 °C で 10 分に増やします。

PCRBIO Taq DNA Polymerase は血液サンプルからの DNA の増幅に使用できますか？

血液サンプルから DNA を増幅するには、PCRBIO HS Taq DNA Polymerase の使用をお勧めします。PCRBIO Taq DNA Polymerase を使用する場合は、2 µL の血液サンプルを 50 µL の PCR 反応に使用し、一般的なプロトコルに従ってください。血液成分が PCR 反応を阻害する可能性があることに注意してください。PCR 増幅に最適なテンプレート濃度を見つけるために、サンプルの連続希釈を実行します。

PCRBIO Taq DNA Polymerase は校正できますか？

いいえ。PCRBIO Taq DNA ポリメラーゼには 5’-3’ エキソヌクレアーゼ活性がありますが、3’-5’ エキソヌクレアーゼ (校正) 活性はありません。

PCRBIO Taq DNA Polymerase は PCR 産物に A テールまたは平滑末端を生成しますか？

PCRBIO Taq DNA Polymerase で生成されたPCR産物はAテール化されており、TAベクターへのクローニングに適しています。詳細については、この文献[1]を参照してください。

1. Yao, S., Hart, D. J. & An, Y. Recent advances in universal TA cloning methods for use in function studies. Protein Eng Des Sel, doi:10.1093/protein/gzw047 (2016).

私の結果には、非特異的なアンプリコンやスメアのバックグラウンドが多く含まれています。トラブルシューティングについて何かアドバイスはありますか？

スメアが懸念される場合は、それが最適ではない条件でアガロースゲル電気泳動を実行したことによるアーティファクトではないことを確認することをお勧めします。最適ではない条件には、高電圧やゲルが固まるのに十分な時間を与えないことが含まれます[1]。

また、PCR 反応のトラブルシューティングを行い、以下の提案を検討する必要がある場合もあります [2]。

• プライマーは、プライマー間の相互作用を防ぎ、特異性を向上させるように設計する必要があります
• アニーリング温度を上げるか、アニーリング温度勾配 PCR を実施して最適なアニーリング温度を決定します
• 反応中のテンプレートの量を減らします。高品質の DNA を得るには、50 µL 反応あたり 1 ～ 100 ng のゲノム DNA または 5 ng 以下のプラスミド / ラムダ DNA を使用します
• サイクル数を減らします
• 反応あたりの酵素量を減らします
• プライマー濃度を下げますが、各プライマーの濃度は 100 nM 以上にしてください
• 最終濃度が 5% ～ 10% になるように反応液に DMSO を含めます

1. Koontz, L. Agarose Gel Electrophoresis. Laboratory methods in enzymology : DNA. First edition. edn, Vol. 529 35-45 (2013).
2. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp, e3998, doi:10.3791/3998 (2012).

私の結果では、収率が非常に低いことがわかりました。トラブルシューティングについて何かアドバイスはありますか？

以下の提案を検討し、文献[1]も参照するとよいでしょう。

• アニーリング温度勾配 PCR におけるアニーリング温度を最適化します
• 反応中のテンプレートの量を増やしてください
• サイクル数を増やしてください
• 反応あたりの酵素の量を増やします
• プライマー濃度を増やしますが、各プライマーの濃度が 1 μM を超えないようにしてください
• 新鮮なdNTP溶液を試してください
• MgCl₂を最適化します

1. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp, e3998, doi:10.3791/3998 (2012).

アガロースゲル上での Red Mix 色素の見かけの Mw はどれくらいですか？

この非阻害性色素は、ゲルへの直接ローディングを可能にするために添加されており、1% アガロースゲルでは 200 ～ 300 bp、2% アガロースゲルでは 50 ～ 100 bp の DNA フラグメントと同様の速度で泳動します。異なるアガロース含有量のゲルを泳動すると、この見かけの分子量に変化が見られる場合があります。

PCRBIO Taq DNA Polymerase と PCRBIO HS Taq DNA Polymerase の違いは何ですか？

PCRBIO HS Taq DNA Polymerase は独自の抗体媒介ホットスタート技術を使用していますが、PCRBIO Taq DNA Polymerase にはこの機能がありません。抗体と Taq DNA ポリメラーゼの相互作用により、ホット スタート ステップまで酵素は不活性のままになります。

ホット スタートとは、95°C での最初の活性化ステップを指し、その後 DNA ポリメラーゼに結合した抗体を不活性化します。65°C 未満で Taq DNA ポリメラーゼが不活性化されると、プライマーダイマーの形成と非特異的増幅が防止されます。これにより、コピー数の少ないターゲット シーケンスから特異的な増幅が可能になります。

PCRBIO Taq DNA Polymerase のエラー率はどれくらいですか？

この酵素のエラー率は、取り込まれたヌクレオチド 2.0 x 10⁵ あたり約 1 個のエラーです。

PCRBIO Taq DNA ポリメラーゼの推奨伸長時間はどれくらいですか？

1kb から 5kb までのアンプリコンの場合、真核生物 DNA からの増幅には 15 秒/kb を推奨します。より短いアンプリコンの場合は、1 秒の伸長で十分です。