PCRBIO Rapid Extract Lysis Kit を使用すると、PCR 対応 DNA の抽出を迅速かつ簡単に行うことができます。

PCRBIO Rapid Extract Lysis Kit は、便利で使いやすいフォーマットでの迅速な DNA 抽出を提供します。このキットには、ダウンストリーム PCR または qPCR 反応で使用するための PCR 対応 DNA の生成を可能にする溶解およびプロテアーゼバッファー システムが含まれています。

さまざまな種類のサンプルに最適化されたこの迅速かつシンプルなキットを使用すると、手間と時間のかかる DNA 抽出法の必要性がなくなります。このキットは、マウスの尾や耳などの固形組織に特に適しており、軟組織、毛包、頬粘膜スワブ、哺乳類の血液、FFPE 組織にも使用できます。

PCRBIO Rapid Extract PCR Kit を使用して、標準的な 15 分間のプロトコルに従って、マウスの尾の切り取り部分 3 mg から DNA を抽出しました。抽出は、他のメーカーの同等の抽出キットを使用して繰り返しました。各上清から連続 3 倍希釈系列を作成しました。PCRBIO HS Taq Mix Red を使用して、各希釈液からマウス GAPDH 遺伝子の 1 kb フラグメントを増幅しました。結果はアガロース ゲル電気泳動で比較しました。行 1 は PCR Biosystems、行 2 は Kapa Biosystems、行 3 は Bioline、行 4 は Sigma、行 5 は Fermentas の結果を示しています。

PCRBIO Rapid Extract PCR Kit を使用して、標準的な 15 分間のプロトコルに従って 3 mg のマウス耳切りから DNA を抽出しました。抽出は、他のメーカーの同等の抽出キットを使用して繰り返しました。各上清から連続 2 倍希釈系列を作成しました。付属のポリメラーゼを使用して、各希釈からマウス Calnexin 遺伝子の 2.5kb フラグメントを増幅しました。結果はアガロース ゲル電気泳動で比較しました。行 1 は PCR Biosystems、行 2 は Kapa Biosystems、行 3 は Bioline、行 4 は Sigma の結果を示しています。

PCRBIO Rapid Extract PCR Kit

PCRBIO Rapid Extract Lysis Kit を使用して、ろ紙上の数十個の細胞から DNA を抽出して増幅できますか？

当社の PCR ミックスは、反応あたり 10 コピー以上のテンプレートで確実に機能しますが、それより少ない場合は機能しません。抽出した DNA は可能な限り少量にし、プロテアーゼを不活性化した後はそれ以上希釈しないでください。より多くの細胞でアッセイを設定し、条件が確立されたら、そこからスケールダウンすることをお勧めします。

PCRBIO Rapid Extract Lysis Kit は、単一コロニーまたは細菌細胞溶解物から DNA を抽出して増幅するために使用できますか？

はい、細菌コロニーまたは細菌細胞溶解物から DNA を増幅するために使用できますが、通常のコロニー PCR を実行するために Rapid Extract PCR キットを使用する必要はありません。細菌コロニーを使用する場合は、滅菌チップを使用してコロニーを選択し、50µl の PCR 反応液に再懸濁します。液体培養物から作業する場合は、終夜培養液 5μl を最終混合物に加えます。一般的なプロトコルに従い、最初の変性時間を 95°C で 10 分に増やします。

qPCR の場合、PCRBIO Rapid Extract Lysis Kit を使用して DNA を抽出し、バックグラウンド ノイズを低減し、反応に加える DNA の量を制御することが重要な場合があります。

抽出した DNA は -20 ℃ で長期保存できますか？

抽出した DNA は短期的には -20°C で保存することをお勧めしますが、長期保存の場合は DNA を精製して標準バッファーに再懸濁することをお勧めします。

抽出した DNA は qPCR に使用できますか？

はい、PCRBIO Rapid Extract Lysis Kit を使用して qPCR のテンプレートを作成できます。PCRBIO Rapid Extract Lysis Kit を使用してテンプレートを準備し、qPCR キットの指示に従ってそのテンプレートを qPCR 反応で使用します。

抽出された DNA は PCRBIO 以外のポリメラーゼによって増幅される可能性はありますか？

抽出された DNA は他のメーカーの PCR キットにも適しているはずです。

プロテアーゼを 95 ℃ で不活性化することが重要ですか？

プロテアーゼは非常に活性の高い酵素であり、熱変性ステップで適切に不活性化されない場合、PCR ステップ中にポリメラーゼが急速に分解される可能性があります。

PCRBIO Rapid Extract Lysis Kit を使用する前に羽毛を分解するために必要な条件は何ですか？

ケラチンを分解するために、羽毛に 200 mM DTT を加え、一晩放置します。

PCRBIO Rapid Extract Lysis Kit には何が含まれていますか？

5x PCRBIO Rapid Extract Buffer A (Lysis バッファー)、10x PCRBIO Rapid Extract Buffer B (プロテアーゼバッファー)

PCRBIO Rapid Extract Lysis Kit と PCRBIO Rapid Extract PCR Kit の違いは何ですか？

PCRBIO Rapid Extract PCR Kit には、PCRBIO Rapid Extract Lysis Kit に加えて、その後の PCR 増幅用の PCRBIO HS Taq Mix Red と同じ内容が含まれています。

FFPE の推奨サイズはどれくらいですか？

ホルマリン固定パラフィン包埋（Formalin-Fixed Paraffin-Embedded：FFPE）組織標本の場合、10 µm 断面の 1～2 mm² を推奨します。これより少ない量を使用すると、PCR に十分な DNA が得られない可能性があります。

PCRBIO Rapid Extract PCR Kit ではどのサンプルを使用できますか？

Rapid Extract PCR Kitは以下の組織リストでテストされました

• 哺乳類細胞培養
• さまざまな生物の動物組織（魚、ロブスター、マウスの尾/耳、ゼブラフィッシュ、線虫、腎臓、毛包）
• ショウジョウバエ、蚊、甲虫（脚、翅）などの昆虫
• 口腔スワブ
• グラム陽性菌
• 真菌菌糸
• 便サンプル
• FFPE
• 血液[1]
• 魚鱗クリップ

以下の組織では、PCRBIO Rapid Extract プロトコルを開始する前に前洗浄ステップが必要になる場合があります[2]。

• 酵母[2],[3]（スフェロプラストを得るために前洗浄または酵素分解酵素で消化）
• 羽毛[4] (プロトコルの変更が必要、下記参照)
• 便サンプル[5]（阻害物質を除去するために希釈系列が必要）

開始材料の量が少ない場合は、抽出した DNA を可能な限り少量に保ち、プロテアーゼを不活性化した後のさらなる希釈を避けることをお勧めします。

1. Batubara, A. et al. 2016. Study of BMP15 gene polymorphism in Boer, Kacang, and Boerka goats. Jurnal Ilmu Ternak Dan Veteriner 21(4): 224-230.　DOI: http://dx.doi.org/10.14334/jitv.v21i4.1636 (2016).
2. Inglis, P.W. et al. 2018. Fast and inexpensive protocols for consistent extraction of high quality DNA and RNA from challenging plant and fungal samples for high throughput SNP genotyping and sequencing Applications. PLOS ONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0206085 October 18.
3. Suzuki, T. & Iwahashi, Y. 2013. RNA preparation of Saccharomyces cerevisiae using the digestion method may give misleading results. Appl Biochem Biotechnol 169:1620–1632 DOI 10.1007/s12010-012-0051-8
4. Bello, N. et al. 2001. Isolation of genomic DNA from feathers. J Vet Diagn Invest 13:162–164
5. Nantavisai, K. et al. 2007. Evaluation of the sensitivities of DNA extraction and PCR methods for detection of Giardia duodenalisin stool specimens. J. Clinical Microbiology. 45: 581–583  doi:10.1128/JCM.01823-06

上清の色が変化したのはなぜですか？

上清の色の変化は、組織から上清に色素が放出されたか、pH の変化が原因である可能性があります。上清の色の変化は必ずしも PCR 反応に影響を与えるわけではありません。

サンプルに高レベルの阻害物質が含まれている場合（血液や便のサンプルなど）、PCR 反応は機能しますか？

PCRBIO Rapid Extract Lysis Kit はヒトの血液にも使用できますが、血液成分により PCR 反応が阻害される場合があります。そのため、PCR 増幅に最適なテンプレート濃度を見つけるために、抽出した DNA を段階希釈することをお勧めします。

増幅が最適でない場合は、PCR 反応の前に DNA のイソプロパノール/酢酸沈殿を実行することをお勧めします。