PCRBIO HS Taq DNA Polymerase は、高速で特異性が高く、感度の高い PCR 用に設計された、高度な抗体媒介ホット スタート Taq DNA ポリメラーゼです。

PCRBIO HS Taq DNA Polymerase は、高速、高特異性、高感度の PCR のために設計された高度な抗体媒介ホットスタート酵素です。ポリメラーゼ技術と緩衝液化学の最新の開発により、PCR 速度、収量、特異性が向上し、GC と AT リッチの配列の両方を含む幅広いテンプレートで一貫して高いパフォーマンスが得られます。

独自の抗体は、95℃での最初の活性化ステップまでポリメラーゼ活性を阻害し、プライマーダイマーと非特異的産物の形成を防止し、他の方法と比較して特異性と感度が向上します。酵素とバッファー システムにより、哺乳類のゲノム DNA などの複雑なテンプレートで優れた PCR パフォーマンスが得られます。高スループットのホット スタート アッセイ、自動反応セットアップ、または低コピー数テンプレートの検出が必要な場合でも、PCR Biosystems 社はお客様のニーズを満たす堅牢な業界最先端の酵素を提供します。

PCRBIO HS Taq DNA Polymerase は、プライマーとテンプレートを除くすべての反応成分が含まれた、すぐに使用できる便利な 2x ミックスとしてもご利用いただけます。PCRBIO HS Taq Mix Red には、直接ゲルにロードするための事前にロードされた赤色色素が含まれています。

1kb フラグメント (GAPDH 遺伝子) の PCR 増幅は、マウスゲノム DNA の 10 倍希釈系列 (5000、500、50、5pg) と PCRBIO HS Taq DNA ポリメラーゼ (紫) および対応する競合他社のホット スタート Taq ポリメラーゼを使用して実行されました。反応はマスター ミックス フォーマットを使用してセットアップされ、メーカーの推奨事項 (NEB (オレンジ)、Promega (黄色)、Thermo (赤)) に従いました。サイクル条件は、95°C 2 分、その後 95°C 15 秒、63°C 15 秒、72°C 30 秒を 40 サイクルでした。反応容量の 1/5 を 1% アガロース ゲルにロードしました。L: PCRBIO ラダー II。PCRBIO Taq DNA ポリメラーゼは、テストした競合他社の製品と同等か、それよりも優れています。

開始時のテンプレート量は 5ng のマウスゲノム DNA でした。増幅されたフラグメントは 3 つの異なる遺伝子に属し、GC 含有量に応じて選択されています (GAP800 bp で 49% GC、ATX500 bp で 69% GC および 71% GC の ATX600 bp)。PCRBIO HS Taq Mix Red (紫) および競合他社の対応するホット スタート Taq ミックスは、メーカーの推奨に従って使用されました: NEB (オレンジ、標準形式と GC バッファー形式の両方)、Promega (黄色)、および Thermo (赤)。サイクル条件は、95°C 5 分、その後 95°C 15 秒、60°C 15 秒、72°C 20 秒の 40 サイクルでした。反応容量の 2/5 を 1.2% アガロース ゲルにロードしました。L: PCRBIO Ladder III。

マウスゲノム DNA の 10 倍希釈系列 (5000、500、50、5pg) と PCRBIO HS Taq Mix Red (紫) および対応する競合他社のホット スタート Taq ミックスを使用した、GAPDH 遺伝子の 1kb フラグメントの PCR 増幅。反応は、製造元の推奨事項 (NEB (オレンジ)、Promega (黄色)、Thermo (赤)) を使用してセットアップしました。サイクル条件は、95°C 2 分、次に 95°C 15 秒、63°C 15 秒、72°C 30 秒を 40 サイクル (NEB の場合: 94°C 2 分、次に 94°C 15 秒、63°C 15 秒、68°C 30 秒を 40 サイクル) でした。反応容量の 2/5 を 1% アガロース ゲルにロードしました。L: PCRBIO Ladder II。

PCRBIO HS Taq DNA Polymerase

PCRBIO HS Taq Mix

PCRBIO HS Taq Mix Red

HS Taq DNA Polymerase (250 U/μL)

HS Taq Antibody (10 mg/mL)

PCRBIO HS Taq DNA Polymerase はマルチプレックス PCR に使用できますか？

当社の PCRBIO HS Taq DNA Polymerase は、低温で Taq ポリメラーゼの活性をブロックするホット スタート テクノロジーを備えているため、マルチプレックス化に特に適しています。度などの反応パラメーターの最適化が必要になる場合があることに注意してください。

マルチプレックス PCR を初めて実行する場合、55°C から 65°C のアニーリング温度勾配を実行することをお勧めします。最良の特異性をもたらすアニーリング温度は、その後の実験で使用する必要があります。マルチプレックス PCR には高速サイクリング条件を使用しないでください。最初は 90 秒の伸長時間を推奨しますが、収量を増やすためにこの時間を延長することもできます。

マルチプレックス反応の場合、反応は最初から最後まで氷上または冷却ブロック上で行う必要があります。プライマーは、末端検出法で簡単に分析できる多様なアンプリコン長を維持しながら、配列の重複をできるだけ避けるように慎重に設計する必要があります[1]～[3]。

1. Markoulatos, P., Siafakas, N. & Moncany, M. Multiplex polymerase chain reaction: a practical approach. J Clin Lab Anal 16, 47-51, doi:10.1002/jcla.2058 (2002).
2. Radhika, M., Saugata, M., Murali, H. S. & Batra, H. V. A novel multiplex PCR for the simultaneous detection of Salmonella enterica and Shigella species. Brazilian Journal of Microbiology 45, 667-676, doi:10.1590/s1517-83822014005000041 (2014).
3. Perez-Perez, F. J. & Hanson, N. D. Detection of plasmid-mediated AmpC beta-lactamase genes in clinical isolates by using multiplex PCR. J Clin Microbiol 40, 2153-2162, doi:10.1128/jcm.40.6.2153-2162.2002 (2002).

PCRBIO HS Taq DNA Polymerase はコロニー PCR に使用できますか？

はい。細菌コロニーを使用する場合は、滅菌チップを使用してコロニーを選択し、50 µL の PCR 反応液に再懸濁します。液体培養から作業している場合は、最終混合物に 5 µL の一晩培養液を追加します。一般的なプロトコルに従い、最初の変性時間を 95 °C で 10 分に増やします。

PCRBIO HS Taq DNA Polymerase は血液サンプルからの DNA の増幅に使用できますか？

はい。2 µL の血液サンプルを 50 µL の PCR 反応に使用し、一般的なプロトコルに従ってください。血液成分が PCR 反応を阻害する可能性があることに注意してください。PCR 増幅に最適なテンプレート濃度を見つけるために、サンプルの連続希釈を実行します。

PCRBIO HS Taq DNA Polymerase は校正できますか？

いいえ。PCRBIO HS Taq DNA Polymerase には 5’-3’ エキソヌクレアーゼ活性がありますが、3’-5’ エキソヌクレアーゼ (校正) 活性はありません。

PCRBIO HS Taq DNA Polymerase は PCR 産物に A テールまたは平滑末端を生成しますか？

PCRBIO HS Taq DNA Polymerase で生成されたPCR産物はAテール化されており、TAベクターへのクローニングに適しています。詳細については、この文献[1]を参照してください。

1. Yao, S., Hart, D. J. & An, Y. Recent advances in universal TA cloning methods for use in function studies. Protein Eng Des Sel, doi:10.1093/protein/gzw047 (2016).

私の結果には、非特異的なアンプリコンやスメアのバックグラウンドが多く含まれています。トラブルシューティングについて何かアドバイスはありますか？

スメアが懸念される場合は、それが最適ではない条件でアガロースゲル電気泳動を実行したことによるアーティファクトではないことを確認することをお勧めします。最適ではない条件には、高電圧やゲルが固まるのに十分な時間を与えないことが含まれます[1]。

また、PCR 反応のトラブルシューティングを行い、以下の提案を検討する必要がある場合もあります [2]。

• プライマーは、プライマー間の相互作用を防ぎ、特異性を向上させるように設計する必要があります
• アニーリング温度を上げるか、アニーリング温度勾配 PCR を実施して最適なアニーリング温度を決定します
• 反応中のテンプレートの量を減らします。高品質の DNA を得るには、50 µL 反応あたり 1 ～ 100 ng のゲノム DNA または 5 ng 以下のプラスミド / ラムダ DNA を使用します
• サイクル数を減らします
• 反応あたりの酵素量を減らします
• プライマー濃度を下げますが、各プライマーの濃度は 100 nM 以上にしてください
• 最終濃度が 5% ～ 10% になるように反応液に DMSO を含めます

1. Koontz, L. Agarose Gel Electrophoresis. Laboratory methods in enzymology : DNA. First edition. edn, Vol. 529 35-45 (2013).
2. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp, e3998, doi:10.3791/3998 (2012).

私の結果では、収率が非常に低いことがわかりました。トラブルシューティングについて何かアドバイスはありますか？

以下の提案を検討し、文献[1]も参照するとよいでしょう。

• アニーリング温度勾配 PCR におけるアニーリング温度を最適化します
• 反応中のテンプレートの量を増やしてください
• サイクル数を増やしてください
• 反応あたりの酵素の量を増やします
• プライマー濃度を増やしますが、各プライマーの濃度が 1 μM を超えないようにしてください
• 新鮮なdNTP溶液を試してください
• MgCl₂を最適化します

1. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp, e3998, doi:10.3791/3998 (2012).

アガロースゲル上での Red Mix 色素の見かけの Mw はどれくらいですか？

この非阻害性色素は、ゲルへの直接ローディングを可能にするために添加されており、1% アガロースゲルでは 200 ～ 300 bp、2% アガロースゲルでは 50 ～ 100 bp の DNA フラグメントと同様の速度で泳動します。異なるアガロース含有量のゲルを泳動すると、この見かけの分子量に変化が見られる場合があります。

PCRBIO Taq DNA Polymerase と PCRBIO HS Taq DNA Polymerase の違いは何ですか？

PCRBIO HS Taq DNA Polymerase は独自の抗体媒介ホットスタート技術を使用していますが、PCRBIO Taq DNA Polymerase にはこの機能がありません。抗体と Taq DNA ポリメラーゼの相互作用により、ホット スタート ステップまで酵素は不活性のままになります。

ホット スタートとは、95°C での最初の活性化ステップを指し、その後 DNA ポリメラーゼに結合した抗体を不活性化します。65°C 未満で Taq DNA ポリメラーゼが不活性化されると、プライマーダイマーの形成と非特異的増幅が防止されます。これにより、コピー数の少ないターゲット シーケンスから特異的な増幅が可能になります。

PCRBIO Hot Start Taq DNA Polymerase のエラー率はどれくらいですか？

この酵素のエラー率は、取り込まれたヌクレオチド 2.0 x 10⁵ あたり約 1 個のエラーです。

PCRBIO Hot Start Taq DNA Polymerase の推奨伸長時間はどれくらいですか？

1kb から 5kb までのアンプリコンの場合、真核生物 DNA からの増幅には 15 秒/kb を推奨します。より短いアンプリコンの場合は、1 秒の伸長で十分です。