PCRBIO 1-Step Go RT-PCR Kit は、1 本のチューブで cDNA 合成と PCR を迅速かつ効率的に実行できる、便利で使いやすいキットです。

PCRBIO 1-Step Go RT-PCR Kit は、1 本のチューブで cDNA 合成と PCR を迅速かつ効率的に行うことができる、便利で使いやすいキットです。再設計されたバッファー システムと改良された逆転写酵素により、PCR Biosytems 社オリジナルの 1 ステップ RT-PCR キットに比べて収量と感度が向上しています。

このキットは、改良された耐熱性逆転写酵素 (RTase Go) と高度な RNase 阻害剤を組み合わせて、cDNA 合成の速度と収量を高めます。PCR ステップは PCRBIO HS Taq DNA Polymerase によって実行され、最適化を最小限に、または最適化をまったく必要とせずに堅牢な RT-PCR パフォーマンスを実現します。PCR Biosytems 社の抗体媒介ホットスタート技術は、プライマーダイマーの形成と非特異的増幅を防止し、他の方法と比較して反応感度と特異性を向上させます。

PCRBIO 1-Step Go RT-PCR Kit は、mRNA、トータル RNA、ウイルス RNA 配列を含むあらゆる RNA テンプレートで使用でき、最も困難なターゲットであっても信頼性の高い検出を実現します。

PCRBIO 1-Step Go RT-PCR Kit

ホットスタート DNA ポリメラーゼの活性化時間を変更できますか？

ポリメラーゼの活性化には少なくとも 2 分間かけることをお勧めします。酵素に悪影響を与えることなく、最長 15 分間まで長く使用することもできます。

1 ステップ反応と 2 ステップ反応のどちらが必要ですか？

１-Step

cDNA 合成と PCR 反応の両方が同じミックスで発生します。このオプションは、そのスピードとセットアップの容易さから、高スループット アプリケーションに適しています。汚染のリスクも軽減されます。低品質の RNA サンプルや、cDNA をアーカイブまたは別の分析に必要とする場合は、理想的ではありません。

２-Step

cDNA 合成と PCR 反応は別々に行われます。cDNA 産物を分析用に保持する必要がある場合は、このオプションの方が適しています。また、反応の最適化のレベルも高くなります。酵素の種類と濃度、RNA 入力、cDNA の濃度を制御できるため、1 ステップ形式に比べて感度が高くなります。

RT 反応で RNase 阻害剤を使用する必要はありますか？

いいえ、RTase Go には、劣化を防ぎ感度を高めるための RNase 阻害剤が含まれています。

生成物の低値または遅い Ct 値に関する一般的なトラブルシューティング

Ct 値が異常に遅い場合は、テンプレート RNA を希釈してみてください。これにより、存在する可能性のある阻害物質が反応を阻害しない濃度まで希釈されます。さらに、逆転写ステップを 55 °C に上げ、アニーリング/伸長温度を上げてみてください。これにより、RNA テンプレートやプライマーに存在する二次構造によって生じる問題の解決に役立つ場合があります。

反応阻害が関与している可能性がある場合は、テンプレートの量を減らすか[1]、反応に0.4～4.4 mg/mlのBSAを加えてみてください[2]。

より具体的な問題については、次の情報を添えてお問い合わせください。

• アンプリコンのサイズ
• 反応セットアップ
• サイクリング条件
• 増幅トレースと融解プロファイルのスクリーンショット

1. Scipioni et al. A SYBR Green RT-PCR assay in single tube to detect human and bovine noroviruses and control for inhibition. Virology Journal.5:94 (2008). doi: 1186/1743-422X-5-94
2. Plante et al. The use of bovine serum albumin to improve the RT‐qPCR detection of foodborne viruses rinsed from vegetable surfaces. Applied Microbiology. 52:3 (2010) doi: https://doi.org/10.1111/j.1472-765X.2010.02989.x

高感度 RT-PCR には mRNA の単離が必要ですか？

通常、mRNA の分離は必要ありません。qPCRBIO Probe 1-Step Go Kit は、1 pg の総 RNA または 0.01 pg の mRNA を含むサンプルでも機能するように開発されています。

希少な mRNA 種を扱う場合は、感度を高めるために RT 反応で配列特異的プライマーを使用します。

どのようなプライミング方法を使用できますか？

遺伝子特異的プライマーは 1 ステップ反応で使用できます。

増幅できるアンプリコンのサイズはどれくらいですか？

PCRBIO 1-Step Go RT-PCR Kit は、真核生物の DNA から最大 3 kb のサイズのアンプリコンを増幅するために開発されました。

PCRBIO 1-Step Go RT-PCR Kit、qPCRBIO Probe 1-Step Go、qPCRBIO SyGreen 1-Step Detect|Go キットの違いは何ですか？

PCRBIO 1-step Go RT-PCR Kit は、エンドポイント RT-PCR 用に開発されました。qPCRBIO Probe 1-Step Go および qPCRBIO SyGreen 1-Step Detect|Go は、それぞれリアルタイム RT-PCR 用のプローブおよび色素ベースのオプションです。

このミックスはマイクロ RNA テンプレートに使用できますか？

はい、PCRBIO 1-Step Go RT-PCR Kit はマイクロ RNA テンプレートに使用できます。専用のキットは販売していませんが、当社の RTase はすべて miRNA の定量化と分析に使用できます。

次の 2 つのアプローチのいずれかをお勧めします。

• ユニバーサル RT プライマーを使用して、ポリ (A) またはポリ (U) テールを追加し (例: ポリ (U) ポリメラーゼによる)、続いてユニバーサルプライマーを使用して cDNA を合成します。[1], [2]
• 特定の RT プライマーを使用し、テーリング ステップ を省略します。[1],[3]-[5]

これらのアプローチの詳細がよくわからない場合は、ガイドラインとして以下のリストを参照してください。

1. Dave, V. P. et al. MicroRNA amplification and detection technologies: opportunities and challenges for point of care diagnostics. Lab Invest 99, 452-469, doi:10.1038/s41374-018-0143-3 (2019).
2. Mei, Q. et al. A facile and specific assay for quantifying microRNA by an optimized RT-qPCR approach. PLoS One 7, e46890, doi:10.1371/journal.pone.0046890 (2012).
3. Chen, C. et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res 33, e179, doi:10.1093/nar/gni178 (2005).
4. Raymond, C. K., Roberts, B. S., Garrett-Engele, P., Lim, L. P. & Johnson, J. M. Simple, quantitative primer-extension PCR assay for direct monitoring of microRNAs and short-interfering RNAs. RNA 11, 1737-1744, doi:10.1261/rna.2148705 (2005).
5. Androvic, P., Valihrach, L., Elling, J., Sjoback, R. & Kubista, M. Two-tailed RT-qPCR: a novel method for highly accurate miRNA quantification. Nucleic Acids Res 45, e144, doi:10.1093/nar/gkx588 (2017).