NGSBIO Library Quant Kit Blue には、Illumina^® NGS システム用に調製されたライブラリーの正確かつ高感度な定量化に必要なすべてのコンポーネントが含まれています。

NGSBIO Library Quant Kit Blue は、Illumina^® NGS システム用に調製されたライブラリーの定量化のための信頼性の高い qPCR ベースのメソッドを提供します。このキットには、5 つの DNA スタンダード、P5 および P7 イルミナ アダプター シーケンスに特異的なプライマー、および qPCRBIO SyGreen® Blue Mix が含まれています。当社のブルー qPCR ミックスには、反応ミックスの可視性を向上させる非反応性染料が含まれており、リアルタイム PCR のパフォーマンスに影響を与えることなく、ピペッティング精度を高め、エラーを減らします。高度な qPCR バッファー システムは、GC または AT リッチなライブラリーを含むすべてのライブラリーの効率的な増幅を保証するために、当社のハイスループット スマート スクリーン テクノロジーを使用して開発されました。このキットには便利なライブラリー希釈バッファーも付属しており、VeriFi^® Library Amplification Mix と組み合わせて使用​​することもできます。

qPCR は、ライブラリーの増幅とクラスター生成のテンプレートとして使用できるアダプター結合分子のみを測定するため、NGS ライブラリーを定量化するための最良の方法と考えられています。NGSBIO Library Quant Kit を使用すると、最適なクラスター密度とシーケンス効率の向上に不可欠な高精度の定量化が可能になります。

ライブラリーの定量化はアダプターライゲーション後いつでも使用できますが、クラスター生成前に必ず使用する必要があります。ライブラリ濃度を過大評価するとクラスター密度が不十分になる可能性があり、ライブラリ濃度を過小評価するとクラスター密度が高く飽和する可能性があります。最適なクラスター密度の詳細については、Illumina^® マシンのマニュアルを参照してください。

提供される DNA スタンダードは正確に測定されており、すぐに使用でき、2pM から 0.2fM まで 5 桁の範囲をカバーします。このキットは、PCR 増幅ステップなしで構築されたライブラリを含む低濃度ライブラリの定量化にも適しています。

NGSBIO Library Quant Kit は、すべての qPCR プラットフォームと互換性があり、幅広いサンプル タイプ、フラグメント サイズ (最大 1000 bp)、濃度、GC 含有量にわたって一貫した再現性のあるライブラリ定量を行うように最適化されています。qPCR 選択ツールを使用して、どの ROX バリアントがお使いの機器と互換性があるかを確認してください。

簡単かつ正確なデータ分析のために、NGSBIO ライブラリ定量化ツールの使用をお勧めします。

アダプターがライゲーションされたライブラリ サンプル (紫色) は、NGSBIO Library Quant Kit Blue で提供される 6 つの標準テンプレート (灰色) と並行して実行されます。

増幅曲線の Ct は、標準テンプレートの濃度の対数に対してプロットされます。標準を通して直線曲線がフィッティングされます。未知のサンプルの濃度は、曲線上の位置から計算されます。

NGSBIO Library Quant Kit (紫)、NEBNext^® Library Quant Kit (オレンジ)、および KAPA Library Quantification Kit (緑) を使用した、アダプターが連結された 16 個のライブラリの定量。

NGSBIO Library Quant Kit は、反復間のばらつきが少なく、一貫性が高いことを示しています。定量結果は、NGS ライブラリ定量キットの主要メーカー 2 社によって得られた結果の範囲内です。各グラフの右下隅にある数字は、Invitrogen の Qubit Fluorometer を使用して取得された dsDNA の濃度を表します。

NGSBIO Library Quant Kit Blue for Illumina Lo-ROX

NGSBIO Library Quant Kit Blue for Illumina Hi-ROX

NGSBIO Library Quant Kit Blue for Illumina Separate-ROX

NGSBIO DNA Standards for Illumina

サンプルが基準範囲外です。どのようなトラブルシューティングの提案がありますか？

融解曲線を調べて、ピークが 1 つであることを確認します。複数のピ​​ークが見られる場合、汚染物質が存在するか、アダプターがライゲーションされていない可能性があります。それ以外の場合、サンプルが DNA Standard 1 より前に表示される場合は、サンプルを 100 倍に希釈して繰り返します。サンプルが DNA Standard 5 の後に出現する場合は、100 倍濃縮されたサンプルを使用してください。

標準曲線の間隔が均等ではありません。これは問題になりますか？

標準曲線の全体的な効率が 90% ～ 110% の間にあり、R² 値が 1 に近い場合、これは心配する必要はありません。すべてのスタンダードを通る直線の傾きが 3.1 ～ 3.6 の間にある限り、定量は正確です。

標準曲線の効率は 90 ～ 110% の範囲内にありません。トラブルシューティングの提案はありますか？

曲線に外れ値がないか検査します。データ ポイントのいずれかが近似曲線から離れているように見える場合は、そのデータ ポイントを削除して、効率が向上するかどうかを確認します。信頼できる標準曲線を得るには少なくとも 3 つのスタンダードが必要であるため、最大 2 つのスタンダードを完全に削除できます。ただし、各スタンダードには少なくとも 2 回の測定が必要で、残りのスタンダードに該当するサンプルのみを定量できます。

テンプレートなしコントロール (NTC) を検査し、DNA Standard 5 よりも Cq が高いことを確認します。NTC がスタンダードの範囲内にある場合、スタンダードまたは反応混合物に汚染物質が存在する可能性があります。これは、プレート上の他のサンプル、または実験室の表面や機器に残っている他のライブラリの痕跡に由来する可能性があります。すべての機器と表面を徹底的に洗浄し、新しい試薬のアリコートを使用して実験を繰り返します。

サンプルの溶融分析で他の重要なピークが見つかった場合、それは何を意味しますか？

ピークがスタンダードの融解ピークに見られるショルダーと重なっている場合、これは Illumina® プライマーの増幅である可能性があります。これは、プライマー/テンプレートの比率が高すぎる場合、またはライゲーションされていないアダプターが大量にある場合に発生する可能性があります。ピークが顕著な場合、定量結果は信頼できないため、実験を繰り返す必要があります。マスター ミックスに適切な量のプライマーが追加されていることを確認し、可能であればテンプレートの濃度を高めてください。問題が解決しない場合は、フリー アダプターを除去するために、ライブラリのサイズ選択を再度実行する必要がある可能性があります。

アダプターのピークに対応しない複数のピークが観察された場合、最も考えられる原因は、ライブラリ調製時の汚染またはサイズ選択の失敗です。ライブラリの新しい希釈液で測定を繰り返します。問題が解決しない場合は、そのライブラリのサイズをさらに選択する必要がある可能性があります。

スタンダードの溶融分析で他の重要なピークが見られる場合、それは何を意味しますか？

サンプルの融解ピークの低温側にわずかなショルダーが見られるのは正常です。ショルダーが非常に大きい場合は、追加の Illumina^® Primer mix が追加されたか、またはスタンダードの量が不十分です。この場合、マスターミックスの作成中および反応にスタンダードを添加する際には特別な注意を払って実験を繰り返す必要があります。

スタンダードの融解曲線に複数のピークが見られる場合、反応に汚染物質が混入しています。すべてのスタンダードにピークがある場合、汚染物質はマスター ミックスにあります。新しい試薬のアリコートを使用して実験を繰り返す必要があります。1 つのスタンダードのみの反復実験にピークがある場合、そのスタンダード アリコートは汚染されているため、廃棄する必要があります。

R² 値が 0.99 ～ 1.00 の範囲にない場合はどうなりますか？

R² 値が 1 に近くない場合は、スタンダードが均等に配置されていないことを示しています。標準曲線チャートを調べて、線から遠い点をすべて削除します。それぞれ 2 つの測定値を持つ 3 つのスタンダードがある限り、定量化は正確になります。

適合の品質を必要なレベルまで引き上げることができない場合は、実験を繰り返す必要があります。スタンダード液をピペッティングする際は、正確な量を確保し、汚染を防ぐために細心の注意を払ってください。

NGSBIO Library Quant Kit で得た測定結果が Qubit、分光光度計、または別の方法の測定結果と一致しない場合はどうすればよいですか？

Qubit や分光光度計などの機器は、溶液中に存在する DNA の総量を測定します。Agilent Bioanalyzer による濃度測定についても同じことが当てはまります。NGSBIO Library Quant Kit for Illumina^® は、両方のアダプターが存在する分子のみを定量化します。また、qPCR は、蛍光法や分光法に比べて、DNA を定量化する方法としては一般的にはるかに正確です。これらの異なる測定方法が一致しないのは普通のことです。

qPCR で測定された濃度が別の方法で測定された濃度よりも大幅に低い場合、アダプターライゲーション中にアダプターを正しく取り込んだ分子がごく一部であることを示唆しています。

サンプルの複製に大きな変動が見られる場合はどうすればよいでしょうか？

融解曲線をチェックして、生成物のピークが 1 つであることを確認します。複数のピークがある場合、これはサンプルが汚染または劣化している可能性があること、またはサイズ選択、アダプターライゲーションステップ、またはライブラリー調製中にエラーが発生したことを示唆しています。融解分析でピークが 1 つしか表示されない場合は、不正確なピペッティングが原因と考えられます。サンプルの新しい希釈液を作成し、実験を繰り返します。このとき、正確にピペッティングを行うように注意してください。問題が解決しない場合は、新しいライブラリを作成する必要があるかもしれません。

スタンダードの複製に大きなばらつきが見られる場合はどうすればよいですか？

反復実験間の ± 0.2 サイクルの変動は正常です。融解曲線をチェックして、単一の生成物ピークがあることを確認してください。 (低分子量の肩が存在する場合がありますが、これは正常です)。複数のピークがある場合は、スタンダード液が汚染または劣化していることを示しています。そのスタンダードを分析から除外できる場合は、除外してください。それ以外の場合は、新しいスタンダードを注文して実験を繰り返してください。

融解曲線に、反復間で重なり合う単一のピークが示される場合、その変動は不正確なピペッティングによって発生したと考えられます。スタンダードを正確にピペッティングするように注意しながら、実験を繰り返します。