Lyo-Ready Probe 1-Step Kit は、RNA 配列の超高感度検出用に設計された凍結乾燥可能な RT-qPCR キットです。

Lyo-Ready Probe 1-Step Kit は、プローブベースの RT-qPCR を使用した RNA の超高感度検出用に特別に配合されており、凍結乾燥診断テストの開発に最適です。

凍結乾燥には、常温保存、保存期間の延長、サンプル量の汎用性の向上など、多くの利点があります。このキットは、当社の標準的な 1 ステップ RT-qPCR キットと同様の凍結乾燥後の高性能を提供するように最適化されています。

Lyo-Ready Probe 1-Step Kit には、活性を失わずに信頼性の高い凍結乾燥を保証するために、ホット スタート Taq ポリメラーゼ、dNTP、MgCl₂、賦形剤のブレンドを含むグリセロールフリーの 4x qPCR ミックスが含まれています。抗体媒介ホットスタート技術により、ウイルス由来 cDNA の特異的増幅が保証され、臨床サンプルに含まれる一般的な PCR 阻害剤に対する耐性が向上します。

このキットは、シングルプレックス（参考データ１参照）およびマルチプレックス（参考データ２参照）での SARS-CoV-2 検出が検証されており、凍結乾燥後も効率や感度が低下することなく信頼性の高いパフォーマンスを提供します。

PCR Biosystems 社は、分子診断アッセイはそれぞれ異なり、凍結乾燥プロセスが困難な場合があることを理解しています。初期検証作業を支援するために、テスト用の Lyo-Ready Probe 1-Step Evaluation Kit を提供しています。

Lyo-Ready Probe 1-Step Kit は、ISO 13485 認定の品質管理システムに基づいて製造されており、分子生物学診断用のコンポーネント、試薬、または試薬アセンブリとしてのさらなる製造用途に適しています。

完全に凍結乾燥して水で再構成した後、Lyo-Ready Probe 1-Step Kit (紫色の曲線) または他社製 M の 1-Step mix (青の曲線) を使用して一般的な冬季ウイルス (インフルエンザ A、インフルエンザ B、呼吸器合胞体ウイルス、および SARS-CoV-2) の多重増幅しました。Ct 値は左のパネルに、効率は右のパネルに示されています。各ウイルスゲノムの 4000、400、40、および 4 コピーに相当する RNA テンプレートの 4 段階希釈を使用しました。総反応容量は 20 μL でした。サイクル条件は、45 °C 20 分、95 °C 3 分、および 95 °C 15 秒、60 °C 30 秒の 50 サイクルでした。 Lyo-Ready Probe 1-Step Kit は、競合製品 M と比較して、凍結乾燥後の効率と感度が優れています。

完全に凍結乾燥して水で再構成した後、Lyo-Ready Probe 1-Step Kit (紫色のバー) または他社製 M の 1-Step mix (青色のバー) を使用して一般的な冬季ウイルス (インフルエンザ A、インフルエンザ B、呼吸器合胞体ウイルス、および SARS-CoV-2) のマルチプレックス増幅しました。Ct 値は上部のパネルに、効率は下部のパネルに示されています。RNA テンプレートの 4 つの連続希釈液が使用され、各ウイルスゲノムの 4000、400、40、および 4 コピーに対応しています。総反応容量は 20 µL でした。サイクル条件は、45℃ 20 分、95℃ 3 分、および 95℃ 15 秒、60℃ 30 秒の 50 サイクルでした。 Lyo-Ready Probe 1-Step Kit は、競合製品 M と比較して、凍結乾燥後の効率と感度が優れています。

Lyo-Ready Probe 1-Step Kit をウェット ミックス (青い曲線) または凍結乾燥後に水で再構成したミックス (紫色の曲線) として使用して、一般的な冬季ウイルス (インフルエンザ A、インフルエンザ B、RS ウイルス、および SARS-CoV-2) をマルチプレックス増幅しました。Ct 値は左側のパネルに、効率は右側のパネルに示されています。RNA テンプレートの 4 つの連続希釈液が使用されました。これは、各ウイルス ゲノムの 4000、400、40、および 4 コピーに相当します。総反応容量は 20 µL でした。サイクル条件は、45℃ 20 分、95℃ 3 分、および 95℃ 15 秒、60℃ 30 秒の 50 サイクルでした。Lyp-Ready Probe 1-Step Kit は、凍結乾燥後も効率または感度の大幅な低下を示しません。

Lyo-Ready Probe 1-Step Kit をウェット ミックス (青いバー) または凍結乾燥後に水で再構成したミックス (紫色のバー) として使用して、一般的な冬季ウイルス (インフルエンザ A、インフルエンザ B、RS ウイルス、および SARS-CoV-2) をマルチプレックス増幅しました。Ct 値は上のパネルに、効率は下のパネルに示されています。RNA テンプレートの 4 つの連続希釈液が使用されました。これは、各ウイルス ゲノムの 4000、400、40、および 4 コピーに相当します。総反応容量は 20 μL でした。サイクル条件は、45 °C 20 分、95 °C 3 分、および 95 °C 15 秒、60 °C 30 秒の 50 サイクルでした。Lyo-Ready Probe 1-Step Kit は、凍結乾燥後も効率または感度の大幅な低下を示しません。

Lyo-Ready Probe 1-Step Kit

Pre-Lyo Probe 1-Step Evaluation Kit

Lyo-Ready Probe Mix

Ct 値が何を超えると結果は信頼できなくなりますか？

Ct 値はテンプレート濃度、反応の最適化、機器、研究室によって異なるため、カットオフ Ct 値を選択する際には注意が必要です。一般的に、35 ～ 40 を超える Ct 値は信頼できないと見なされ始めます。ただし、テンプレートのコピー数が少ない場合、反応が非効率的になると Ct が遅くなることがあります。相対的または絶対的な定量化方法を使用してカットオフを標準化することは常に良い方法です。また、遅く増幅された生成物を特定するために、生成物の融解曲線またはゲル電気泳動を実行して分析することをお勧めします。

凍結乾燥前に、Lyo-Ready Probe 1-Step Mix に他の成分を追加できますか？

プライマー、プローブ、ROX以外に、Lyo-Ready Probe 1-Step Mixに追加する他のコンポーネントについてはスクリーニングしていません。追加の凍結乾燥対応コンポーネントを追加する場合は、ウェットミックスと凍結乾燥材料の両方でそれらの活性をテストし、経時的な安定性を評価する必要があります。PCR Biosystems 社は、追加コンポーネントによって生じるパフォーマンスの低下について責任を負いません。

ROX を Lyo-Ready Probe 1-Step Mix に追加できますか？また、反応に悪影響を及ぼす可能性がありますか?？

はい、別売りの ROX (6-カルボキシ-X-ローダミン) をキットに追加することができ、凍結乾燥プロセスに干渉することはありません。

ROX は、主にウェル間の光路の変化によって生じる可能性のある蛍光レベルの変化を正規化するために、ROX 依存型リアルタイム PCR 機器のパッシブリファレンス色素として使用されます。蛍光強度 (Rn) の正規化は、リアルタイム PCR ソフトウェアで、特定のシグナルの蛍光強度を ROX の蛍光強度で除算することによって行われます。

ROX は PCR 反応に関与せず、その蛍光レベルは各ウェル内のテンプレートの量に比例しないため、この蛍光色素を混合物に添加すると、増幅中に一定の蛍光シグナルが得られます。

パッシブリファレンススタンダードを必要とするさまざまなタイプのリアルタイム PCR 機器では、主に各システムの光学構成 (つまり、使用される励起光源と光学系の種類) が異なるため、ROX の最適濃度が異なります。

ROX の添加量が少なすぎたり多すぎたりすると、非常にノイズの多いシグナルが発生し、反応結果に影響を及ぼします。したがって、ユーザーにとって次のことが非常に重要です。

1. リアルタイム PCR 結果を最適化するための正しい ROX 濃度を決定します。
2. 反応の設定に使用したソフトウェアの ROX 設定を確認してください。

最も一般的に使用されるシステムに役立つqPCR選択ツールを活用してください。

HS Taq DNA ポリメラーゼの活性化時間を変更することはできますか？

ポリメラーゼの活性化には少なくとも 2 分間かけることをお勧めします。酵素に悪影響を与えることなく、最長 15 分間まで使用することもできます。

RT 反応で RNase 阻害剤を使用する必要はありますか？

いいえ、キットに含まれる 3200x UltraScript^® RTase には、分解を防止して感度を高めるための RNase 阻害剤がすでに含まれています。

収量が低い、または Ct 値が遅い場合の一般的なトラブルシューティング

Ct 値が異常に遅い場合は、テンプレート RNA を希釈してみてください。これにより、存在する可能性のある阻害物質が反応を阻害しない濃度まで希釈されます。さらに、逆転写ステップを 55 °C に上げ、アニーリング/伸長温度を上げてみてください。これは、RNA テンプレートおよび/またはプライマーに存在する二次構造によって引き起こされる問題を解決するのに役立つ可能性があります。

反応阻害が関係する可能性がある場合は、テンプレートの量を減らす[1]か、反応液に 0.4 ～ 4.4 mg/ml のBSA を追加してください[2]。

より具体的な問題については、次の情報を添えてお問い合わせください。

• アンプリコンのサイズ
• 反応セットアップ
• サイクリング条件
• 増幅トレースと融解プロファイルのスクリーンショット

1. Scipioni et al. A SYBR Green RT-PCR assay in single tube to detect human and bovine noroviruses and control for inhibition. Virology Journal.5:94 (2008). doi: 1186/1743-422X-5-94
2. Plante et al. The use of bovine serum albumin to improve the RT‐qPCR detection of foodborne viruses rinsed from vegetable surfaces. Applied Microbiology. 52:3 (2010) doi: https://doi.org/10.1111/j.1472-765X.2010.02989.x

Lyo-Ready Probe 1-Step Kit の取り扱い方法を教えてください。

Lyo-Ready Probe 1-Step Kit には、4x Lyo-Ready Probe Mixと 3200x UltraScript® Reverse Transcriptase (RTase) の 2 つのコンポーネントが含まれています。使用する 4x Lyo-Ready Probe Mix の各 mL に対して 1.25 μL の 3200x UltraScript RTase を追加する必要があります。RTase は高濃度であるため、供給される量は非常に少ないため、必要な量の酵素をピペッティングする前に毎回チューブを回転させることをお勧めします。

キットの 2 つのコンポーネントは安定しており、保存期間が長くなっています (各コンポーネントの有効期限を参照)。ただし、4x Lyo-Ready Probe 1-Step Mix (3200x UltraScript® RTase を 4x Lyo-Ready Probe Mix に追加して得られる) はすぐに使用する必要があります。または、4 °C で最大 3 日間保存できます。したがって必要な量の 4x Lyo-Ready Probe 1-Step Mix のみを準備し、残りの個別のコンポーネントは -30 °C ～ -15 °C で保管することをお勧めします。

4x Lyo-Ready Probe Mix の MgCl₂ 濃度はどのくらいですか？

4x Lyo-Ready Probe Mix には、18 mM の濃度の MgCl₂ が含まれています。つまり、反応の最終濃度は 4.5 mM になります。

どのようなプライミング方法を使用できますか？

1 ステップ反応では遺伝子特異的プライマーを使用する必要があります。

凍結乾燥で問題が発生した場合はどうすればよいですか？

製品マニュアルでは、Lyo-Ready Probe 1-Step Mix 500 μL を充填した 2 mL ガラスバイアルでテストされた一般的な凍結乾燥プロトコルを提供しています。Lyo-Ready Probe 1-Step Mix を 1 倍または 2 倍 (オリゴヌクレオチドと水で) に希釈すると、凍結乾燥が容易になる (つまり、プログラムが短くなり、ケーキの外観が均一になり、収縮の兆候がなくなる) ことが確認されたため、実行を開始する前にこの希釈を行うことをお勧めします。

凍結乾燥される量、バイアルの材質（ガラスかプラスチックか）、および使用される凍結乾燥装置に応じて、サイクルを最適化できます。

サイクル後にケーキが適切に形成されない場合は、正しいケーキの形成を保証するために、一次乾燥を -50 °C で実行し、時間を延長する、より控えめなサイクルで繰り返すことをお勧めします。必要に応じて、二次乾燥フェーズを延長することもできます。

Lyo-Ready Probe 1-Step Kit を使用してマルチプレックス増幅を行う際に考慮すべきことは何ですか？

プライマーは、同様のアニーリング温度を持ち、ターゲットに特異的であり、プライマーダイマーを形成しないように設計する必要があります。プライミングと増幅に十分なテンプレートを確保するために、逆転写フェーズの長さを 10 分間に延長することができます。

マルチプレックスを実行する場合、各プライマーの推奨濃度はどれくらいですか？

各プライマーは 400～1000 nM の使用をお勧めします。この推奨濃度にはある程度の柔軟性がありますが、プライマー濃度はこの範囲を超えて増やさないでください。酵素の活性に重大な影響を与える可能性があります。通常、プローブの濃度は増幅プライマーの濃度の半分ですが、プライマー セットごとに最適化と検証が必要です。