IsoFast^® Bst 1-Step Mix は、RNA ターゲットを 1 ステップで迅速かつ高感度に等温増幅するためのデュアル酵素システムです。

IsoFast^® Bst 1-Step Mix は、単一チューブ内で標的 RNA の逆転写とその後の等温増幅を行うように設計されています。

このキットは、強力な鎖置換活性を持つ IsoFast® Bst ポリメラーゼを利用しており、熱サイクルを必要とせずに一定温度 (65˚C) で DNA 合成を可能にします。Geobacillus stearothermophilus (旧称 Bacillus stearothermophilus) DNA ポリメラーゼの大きな断片を表すこのタンパク質部分は、DNA の 5’-3’ 合成を触媒しますが、5’-3’ エキソヌクレアーゼドメインは含みません[1]。酵素は、便利な 2x ミックス形式で提供されます。

1. Mead DA, McClary JA, Luckey JA, Kostichka AJ, Witney FR, Smith LM. Bst DNA polymerase permits rapid sequence analysis from nanogram amounts of template. Biotechniques. 1991 Jul;11(1):76-8, 80, 82-87.

高速増幅用に設計された IsoFast^® Bst 1-Step Mix は、幅広いサンプル タイプで迅速かつ一貫した結果を提供し、SARS-CoV-2 核酸の定性検出用に検証されています (参考データ ２)。バッファーの化学特性により、阻害剤が存在する場合など、困難な条件下でも高い収量とパフォーマンスが保証されます。

IsoFast^® Bst 1-Step Mix には、RNA ターゲットの高速かつ高感度な等温増幅に必要なすべてのコンポーネントが含まれており、プライマー、テンプレート、水を追加するだけで済みます。このキットには蛍光色素の別個のチューブが付属しており、あらゆる qPCR 機器でのリアルタイム検出が可能です。

この製品はPCRには適していません。

IsoFast^® Bst 1-Step Mix を使用した、ヒト肺トータル RNA からのベータ アクチンの等温増幅。プライマーミックスは、F3 および B3 プライマーには 0.2 μM、FIP および BIP プライマーには 1.6 μM、LoopF​​ および LoopB プライマーには 0.8 μM を使用しました。総反応容量は 25 μL でした。250 ng、25 ng、2.5 ng、250 pg、25 pg、2.5 pg、および 250 fg の全 RNA に対応する、テンプレートの 7 段階希釈を使用しました。反応は 65 ˚C で 34 分間実行されました。BioRad CFX96 Touch を使用して、10 秒ごとに蛍光を記録しました。結果が得られるまでの時間は、同じ蛍光しきい値に到達するのに必要な時間です。IsoFast^® Bst 1-Step Mix は、トータル RNA 2.5 pg まで迅速かつ高感度に増幅します。

IsoFast^® Bst 1-Step Mix を使用して SARS-CoV-2 RNA の E1 および N2 ターゲットを等温増幅し、NEB WarmStart^® LAMP キットで得られた結果と比較しました。プライマー ミックスは、F3 および B3 に 0.2 μM、FIP および BIP に 1.6 μM、LoopF​​ および LoopB プライマーに 0.8 μM を使用しました。総反応容量は 25 μL でした。SARS-CoV-2 RNA の 40,000、8000、1600、320、64、12.8、2.56 コピーに相当する、テンプレートの 7 段階希釈を使用しました。反応は 65 ˚C で 100 分間実行されました。BioRad CFX96 Touch を使用して、10 秒ごとに蛍光を記録しました。結果が得られるまでの時間は、同じ蛍光しきい値に到達するのに必要な時間です。 IsoFast^® Bst 1-Step Mix を使用すると、テストされた SARS-CoV-2 RNA のすべての希釈度を迅速に検出できます。

IsoFast® Bst 1-Step Mix

IsoFast^® Bst 1-Step Mix は熱で不活性化できますか？

はい、IsoFast® Bst ポリメラーゼと RTase Go はどちらも、チューブを 80°C 以上で 10 分間加熱することで不活性化できます。

IsoFast^® Bst 1-Step Mix は 65°C 以外の温度でも使用できますか？

はい、酵素は 57°C から 65°C の間で活性になります。活性が低下するため、この範囲外の温度での使用はお勧めしません。

IsoFast^® Bst 1-Step Mix はサーマルサイクルシーケンスに使用できますか？

残念ながら、反応温度が高すぎて酵素が安定しないため、できません。

蛍光色素はどのように使用すればよいですか？

インターカレーション蛍光色素は 20 倍の濃度で提供されます。ほとんどのリアルタイム qPCR 機器で反応をモニタリングする場合は、25μL 反応あたり 1.25μL が推奨されます。一般的なリアルタイム蛍光光度計の FAM チャネルを使用して色素を読み取ることができます。

どれくらい早く結果が出るのでしょうか？

インターカレーション蛍光色素は 20 倍の濃度で提供されます。ほとんどのリアルタイム qPCR 機器で反応をモニタリングする場合は、25μL 反応あたり 1.25μL が推奨されます。一般的なリアルタイム蛍光光度計の FAM チャネルを使用して色素を読み取ることができます。

IsoFast^® Bst 1-Step Mix には dNTP が付属していますか？

はい。バッファーとミックスの両方にすでに dNTP が含まれているため、dNTP を別途注文する必要はありません。

IsoFast^® Bst 1-Step Mix キットにはどのようなコンポーネントが含まれていますか？

このキットは、2x IsoFast^® Bst Mix (増幅バッファー、dNTP、MgSO4、IsoFast^® Bst ポリメラーゼを含む) と、逆転写等温増幅用に最適化された濃度の RTase Go で構成されています。このキットには、生成物のリアルタイム検出のために、dsDNA に結合する 20 倍の蛍光色素のチューブ 1 本も含まれています。ユーザーはプライマーとターゲット RNA を追加するだけです。

IsoFast^® Bst ポリメラーゼはどのような場合に選択すべき酵素でしょうか？

IsoFast® Bst ポリメラーゼは、非常に優れた鎖置換活性を備えた DNA ポリメラーゼです。中程度の好熱菌であるBacillus stearothermophilus (最近Geobacillus stearothermophilusに改名)から単離されているため、至適温度60〜65℃は、DNAポリメラーゼ I、クレノウフラグメント、または他の頻繁に使用される鎖置換ポリメラーゼであるphi29ポリメラーゼの温度(37℃)よりも高くなります。

これは、シーケンシング戦略や等温増幅技術の設計に役立ちます。たとえば、反応温度が高いと、GC リッチ領域のシーケンスが容易になります。