サンプルを視覚化するための、見やすい不活性紫色色素を使用した Clara® Probe Mix のパフォーマンスを体験してください。最先端のユニバーサル プローブ ベースの qPCR による DNA ターゲットの検出が、これまでになく簡単になります。

Clara® Probe Purple Mix は、Clara®試薬ファミリーのスピード、感度、特異性と、サンプルの視覚化を容易にする不活性紫色色素を組み合わせたものです。この染料はプローブ蛍光体の消光を大幅に低減し、qPCRの正確な結果を保証すると同時に、取り扱いやピペッティングの手間を軽減します。

Clara® Probe Purple Mixes のプローブの蛍光強度が減少します。

• FAM: up to 25%
• HEX: up to 30%
• Tex: up to 25%
• Cy5: up to 10%

パーセンテージは、少なくとも 2 つの異なる反応におけるプラトーの高さの減少 (Purple Mix と Basic Mix の比較) を表します。

Clara® Probe Mix は、診断アプリケーションや基礎研究において、最高の感度、信頼性、そして最高の使いやすさを備えた qPCR を可能にするように設計されています。これは、TaqMan、Scorpions、分子ビーコンなど、あらゆる種類のプローブ技術に適したユニバーサル qPCR ミックスです。PCR BioSystems 社独自のホット スタート Taq DNA ポリメラーゼを搭載したこの qPCR ミックスは、別の cDNA 合成キットと併用すると、2 ステップ RT-qPCR プロトコルの DNA 検出に適しています。ただし、日常的な RNA 定量には、より合理化されたワークフローのために、Clara® Probe 1-Step Mix を使用した 1 ステップ プロトコルをお勧めします。

Clara® Probe Mix は、遺伝子発現分析、SNP/対立遺伝子検出、遺伝子型判定および対立遺伝子識別研究、種の豊富さの定量化など、あらゆる種類のプローブ ベースの qPCR アプリケーションに使用でき、単一アッセイとマルチプレックス アッセイの両方で高い効率を発揮します。このミックスは汎用性が高く、基礎研究だけでなく体外診断キットの開発にも最適です。

このミックスは、融解曲線分析（ハイブリダイゼーション プローブのみ）にも適しており、パッシブリファレンス色素なし（No-ROX）またはパッシブリファレンス色素あり（Lo-ROX、Hi-Rox、Separate-ROX、AquaPlex 配合）でご利用いただけます。qPCR 選択ツールを使用して、どの ROX バリアントがお使いの機器と互換性があるかを確認してください。

AquaPlex フォーマットは、赤色 (Cy5、650 nm) チャネルでの検出に適したパッシブリファレンス色素を使用して設計されており、ROX 検出に通常使用されるチャネルで監視できるプローブ色素の使用を可能にします。これにより、マルチプレックスアッセイでより最適なシグナル生成とより高品質なデータが可能になります。

プライマーとプローブは慎重に設計してください。高速サイクリング条件下での効率的な増幅のために、80 bp ～ 200 bp のアンプリコン長をお勧めします。すべてのメーカーのマスター ミックスで、アンプリコン長が短いほど、反応を速くサイクリングできます。アンプリコン長は 400 bp を超えてはなりません。プライマーは、デフォルトの Primer 3 設定を使用した場合、約 60 °C の融解温度が予測されます。TaqMan® プローブの場合、5′ プライマーに近いプローブを選択し、末端グアノシン残基は避けてください。特にマルチプレックス反応では、プローブ色素とクエンチャーの理想的な組み合わせを確保してください。

qPCR 実験の設計方法と qPCR 結果の分析方法の詳細については、qPCR テクニカル ガイドを参照してください。

Clara® Probe Mix (ピンクの曲線) または TaqMan® Fast Advanced Master Mix (灰色の曲線) を使用した、一般的なハウスキーピング遺伝子 (GAPDH および β-2 ミクログロブリン [B2M]) の増幅。増幅曲線は左のパネルに、効率は右のパネルに示されています。マウス cDNA テンプレートの 3 回 (GAPDH の場合) または 4 回 (B2M の場合) の連続希釈液が使用されました。これは、それぞれ 1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、または 1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL に相当します。反応容量は 20 μL でした。サイクル条件は、95 °C 2 分、続いて 95 °C 10 秒、60 °C 30 秒の 50 サイクルでした。

Clara® Probe Mix は TaqMan® Fast Advanced Master Mix よりも優れており、テンプレート濃度が低い場合でも、最適な効率で高い感度と再現性のある増幅を示します。

Clara® Probe Mix (紫)、Luna® universal Probe qPCR Master Mix (黄色)、Takara Premix Ex Taq™ (緑)、および TaqMan® Fast Advanced Master Mix (青) を使用した一般的なハウスキーピング遺伝子 (GAPDH および β-2-Microglobulin [B2M]) の増幅。Ct 値は上部パネルに、効率は下部パネルに示されています。マウス cDNA テンプレートの 3 つの連続希釈液が使用されました。これは、1 ng/μL、100 pg/μL、および 10 pg/μL に相当します。サイクル条件は、95 °C 2 分、続いて 95 °C 10 秒、60 °C 30 秒の 50 サイクルでした。

Clara® Probe Mix は、主要な競合製品よりも低い Ct 値と優れた効率を示しています。

Clara® Probe Purple Mix Lo-ROX

Clara® Probe Purple Mix Hi-ROX

Clala® Probe Purple Mix No-ROX

Clara® Probe Purple Mix Separate-ROX

Clara® および Clara® Purple Mix で生成された産物は、消化、クローン化、および配列決定できますか？

はい、これらのミックスで生成された PCR 産物は、野生型 Taq ポリメラーゼで生成された PCR 産物と同じ特性を持っています。標準プロトコルを使用して、制限エンドヌクレアーゼで配列決定または消化することができます。産物は 3′-d(A) 末端で、TA クローニングに使用できます。または、クローニング前に平滑末端にしたり、制限酵素で消化したりすることもできます。最良の結果を得るには、標準的な PCR クリーンアップ キットを使用して PCR 産物を精製することをお勧めします。

Clara® Probe Mix および Clara® Probe 1-Step Mix には FAM 色素が含まれていますか？

いいえ。ROX（キットに含まれている場合）以外に、PCR Biosystems 社のミックスには他の色素は含まれていません。したがって、反応には任意の蛍光体結合プローブを使用できます。

Clara® Probe Mix および Clara® Probe 1-Step Mix の蛍光が競合他社の製品で得られる蛍光と異なるのは正常ですか？

製品によって蛍光のプラトーが異なる場合があります。ただし、これは定量化の精度には影響せず、Ct 値は製品間で異なりません。

1x TE (10 mM Tris-HCl / 1 mM EDTA) バッファーでのサンプル DNA の保存は、Clara® Probe Mix および Clara® Probe 1-Step Mix を使用した後続の qPCR と互換性がありますか？

はい、この保存バッファーは互換性があります。EDTA は混合物中のマグネシウムの一部をキレート化しますが、反応に大きく影響するほどではありません。

Clara® Probe Mix、Clara® Probe 1-Step Mix、および各 Purple Mix の ROX 濃度はどれくらいですか？

パッシブリファレンス色素を含む Clara® Probe Purple および Clara® Probe 1-Step Purple Mix は、異なる配合で提供され、それぞれ異なる濃度のパッシブリファレンス色素を含んでいます。

・Lo-ROX Mix には 200 nM ROX が含まれています
・Hi-ROX Mix には 2 µM ROX が含まれています
・No-ROX Mix には ROX が含まれていません

Separate-ROX Mix には、50 µM ROX 添加剤の別のチューブが含まれています。これにより、使用する ROX の濃度を選択できます。 qPCR 選択ツールを使用して、どのミックスがお使いの qPCR マシンに最適かを判断できます。

qPCR に非特異的な生成物が含まれている場合、どのようなトラブルシューティングが推奨されますか？

反応を最適化する際に考慮すべきさまざまなオプションがあります。

• アニーリング/伸長時間を5秒に短縮する
• アニーリング/伸長温度を60℃から65℃に上げる

DNA テンプレートを希釈するには、まず 5 ng の DNA から始めて、10 倍のテンプレート希釈シリーズを使用します。これらを電気泳動にて非特異的な生成物が残っているかどうかを確認するだけでなく、テンプレート希釈を行った後、qPCR 機器のソフトウェアを使用して反応の効率を計算することもできます。効率が 90 ～ 110% の場合、アンプリコンはサイクルごとに 2 倍になっています。