Clara® Probe Mix は、qPCR のための最新のソリューションです。明確で一貫した結果が得られるこの最先端の qPCR ミックスは、アプリケーションに関係なく、リアルタイム PCR のワークロードを効率化します。

Clara® Probe Mix は、診断アプリケーションや基礎研究において、最高の感度、信頼性、そして最高の使いやすさを備えた qPCR を可能にするように設計されています。これは、TaqMan、Scorpions、分子ビーコンなど、あらゆる種類のプローブ技術に適したユニバーサル qPCR ミックスです。PCR Biosystems 社独自のホット スタート Taq DNA ポリメラーゼを搭載したこの qPCR ミックスは、別の cDNA 合成キットと併用すると、2 ステップ RT-qPCR プロトコルの DNA 検出に適しています。ただし、日常的な RNA 定量には、より合理化されたワークフローのために、Clara® Probe 1-Step Mix を使用した 1 ステップ プロトコルをお勧めします。

Clara® プローブ ミックスは、遺伝子発現分析、SNP/対立遺伝子検出、遺伝子型判定および対立遺伝子識別研究、種の豊富さの定量化など、あらゆる種類のプローブ ベースの qPCR アプリケーションに使用でき、単一アッセイとマルチプレックス アッセイの両方で高い効率を発揮します。このミックスは汎用性が高く、基礎研究だけでなく体外診断キットの開発にも最適です。

このミックスは、融解曲線分析（ハイブリダイゼーション プローブのみ）にも適しており、パッシブリファレンス色素なし（No-ROX）または参照色素あり（Lo-ROX、Hi-Rox、Separate-ROX、AquaPlex 配合）でご利用いただけます。qPCR 選択ツールを使用して、どの ROX バリアントがお使いの機器と互換性があるかを確認してください。

AquaPlex フォーマットは、赤色 (Cy5、650 nm) チャネルでの検出に適したパッシブ参照色素を使用して設計されており、ROX 検出に通常使用されるチャネルで監視できるプローブ色素の使用を可能にします。これにより、マルチプレックスアッセイでより最適なシグナル生成とより高品質なデータが可能になります。

マウス RNA によるシングルプレックス感度。Cara Probe 1-Step Mix を使用したシングルプレックス設定での一般的なハウスキーピング遺伝子 (βアクチンおよび β -2-ミクログロブリン [B2M]) の増幅。増幅曲線は左のパネルに、効率は右のパネルに示されています。マウスの全 RNA テンプレートの 5 つの連続希釈液を使用しました。それぞれ 50 ng/µL、5 ng/µl、500 pg/µL、50 pg/µL、5 pg/µL に相当します。総反応容量は 20 µL でした。サイクル条件は、52℃ 5 分、95℃ 3 分、および 95℃ 15 秒、60℃ 30 秒の 60 サイクルでした。Clara Probe 1-Step Mix は、テンプレートの濃度が低くても、高い感度と再現性のある増幅を示し、最大限の効率を示します。

Clara Probe 1-Step Mix (ピンク色のバー)、Thermo Fisher SuperScript III Platinum OneStep qRT-PCR Kit (緑色のバー)、Thermo Fisher TaqPath 1-Step Multiplex Mastermix (青色のバー)、および NEB Luna Universal Probe One-Step RY-qPCT Kit (黄色のバー) を使用した、一般的な冬のウイルス (インフルエンザ A、インフルエンザ B、RS ウイルス、および SARS-CoV-2) のマルチプレックス増幅。Ct 値は上のパネルに、効率は下のパネルに示されています。RNA テンプレートの 5 段階希釈液が使用されました。これは、各ウイルスゲノムの 40,000、4,000、400、40、および 4 コピーに相当します。総反応容量は 20 µL でした。サイクル条件は、52℃ 15 分、95℃ 3 分、95℃ 15 秒、60℃ 30 秒の 50 サイクルでした。Clara Probe 1-Step Mix は、マルチプレックス設定で最適な効率で、低コピー数のテンプレートでも高感度で再現性の高い増幅を示し、主要な Probe 1-Step Mix の競合製品と同等かそれ以上です。

Clara® Probe Mix (ピンクの曲線) または TaqMan® Fast Advanced Master Mix (灰色の曲線) を使用した、一般的なハウスキーピング遺伝子 (GAPDH および β-2 ミクログロブリン [B2M]) の増幅。増幅曲線は左のパネルに、効率は右のパネルに示されています。マウス cDNA テンプレートの 3 回 (GAPDH の場合) または 4 回 (B2M の場合) の連続希釈液が使用されました。これは、それぞれ 1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、または 1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL に相当します。反応容量は 20 μL でした。サイクル条件は、95 °C 2 分、続いて 95 °C 10 秒、60 °C 30 秒の 50 サイクルでした。

Clara® Probe Mix は TaqMan® Fast Advanced Master Mix よりも優れており、テンプレート濃度が低い場合でも、最適な効率で高い感度と再現性のある増幅を示します。

Clara® Probe Mix (紫)、Luna® universal Probe qPCR Master Mix (黄色)、Takara Premix Ex Taq™ (緑)、および TaqMan® Fast Advanced Master Mix (青) を使用した一般的なハウスキーピング遺伝子 (GAPDH および β-2-Microglobulin [B2M]) の増幅。Ct 値は上部パネルに、効率は下部パネルに示されています。マウス cDNA テンプレートの 3 つの連続希釈液が使用されました。これは、1 ng/μL、100 pg/μL、および 10 pg/μL に相当します。サイクル条件は、95 °C 2 分、続いて 95 °C 10 秒、60 °C 30 秒の 50 サイクルでした。

Clara® Probe Mix は、主要な競合製品よりも低い Ct 値と優れた効率を示しています。

Clara® Probe Mix Lo-ROX

Clara® Probe Mix Hi-ROX

Clala® Probe Mix No-ROX

Clara® Probe Mix Separate-ROX

Clara® Probe Mix AquaPlex

Ct 値がどれくらいの値を超えると結果は信頼できなくなりますか？

Ct 値はテンプレート濃度、反応の最適化、機器、研究室によって異なるため、カットオフ Ct 値を選択する際には注意が必要です。一般的に、35 ～ 40 を超える Ct 値は信頼できないと見なされ始めます。ただし、テンプレートのコピー数が少ない場合、反応が非効率的になると Ct が遅くなることがあります。相対的または絶対的な定量化方法を使用してカットオフを標準化することは常に良い方法です。また、遅く増幅された生成物を特定するために、生成物の融解曲線または電気泳動を実行して分析することをお勧めします。

Clara® および Clara® Purple ミックスで生成された製品は、消化、クローン化、および配列決定できますか？

はい、これらのミックスで生成された PCR 産物は、野生型 Taq ポリメラーゼで生成された PCR 産物と同じ特性を持っています。標準プロトコルを使用して、制限エンドヌクレアーゼで配列決定または消化することができます。産物は 3′-d(A) 末端で、TA クローニングに使用できます。または、クローニング前に平滑末端にしたり、制限酵素で消化したりすることもできます。最良の結果を得るには、標準的な PCR クリーンアップ キットを使用して PCR 産物を精製することをお勧めします。

ROX は反応に悪影響を及ぼす可能性がありますか？

ROX (6-carboxy-X-rhodamine) は、主にウェル間の光路のばらつきによって生じる蛍光レベルの変動を正規化するために、ROX 依存型リアルタイム PCR 機器でパッシブ リファレンス 色素として使用されます。蛍光強度 (Rn) の正規化は、リアルタイム PCR ソフトウェアで、特定の信号の発光強度を ROX の発光強度で割ることによって行われます。

ROX は PCR 反応には関与せず、その蛍光レベルは各ウェルの DNA の量に比例しないため、この蛍光体を混合物に追加すると、増幅中に一定の蛍光信号が得られます。

パッシブ リファレンス スタンダードを必要とするさまざまなタイプのリアルタイム PCR 機器では、主に各システムの光学構成 (つまり、使用される励起源と光学系の種類) が異なるため、ROX の最適濃度が異なります。

ROX の添加量が少なすぎたり多すぎたりすると、非常にノイズの多い信号になり反応の結果に影響を及ぼすため、お客様にとって次のことが非常に重要です:

1. リアルタイム PCR の結果を最適化するために適切な ROX 濃度を決定する
2. 反応を設定するために使用するソフトウェアで ROX 設定を確認する

最も一般的に使用されるシステム用の便利な選択ツールは、こちらにあります。

Clara® Probe Mix および Clara® Probe 1-Step Mix には FAM 色素が含まれていますか？

いいえ。ROX（キットに含まれている場合）以外に、PCR Biosystems 社のミックスには他の色素は含まれていません。したがって、反応には任意の蛍光体結合プローブを使用できます。

Clara® Probe Mix および Clara® Probe 1-Step Mix の蛍光が競合他社の製品で得られる蛍光と異なるのは正常ですか？

製品によって蛍光のプラトーが異なる場合があります。ただし、これは定量化の精度には影響せず、Ct 値は製品間で異なりません。

1x TE (10 mM Tris-HCl / 1 mM EDTA) バッファーでのサンプル DNA の保存は、Clara® Probe Mix および Clara® Probe 1-Step Mix を使用した後続の qPCR と互換性がありますか？

はい、この保存バッファーは互換性があります。EDTA は混合物中のマグネシウムの一部をキレート化しますが、反応に大きく影響するほどではありません。

Clara® Probe Mix、Clara® Probe 1-Step Mix、および各 Purple Mix の ROX 濃度はどれくらいですか？

パッシブリファレンス色素を含む Clara® Probe Purple および Clara® Probe 1-Step Purple Mix は、異なる配合で提供され、それぞれ異なる濃度のパッシブリファレンス色素を含んでいます。

・Lo-ROX Mix には 200 nM ROX が含まれています
・Hi-ROX Mix には 2 µM ROX が含まれています
・No-ROX Mix には ROX が含まれていません

Separate-ROX Mix には、50 µM ROX 添加剤の別のチューブが含まれています。これにより、使用する ROX の濃度を選択できます。 qPCR 選択ツールを使用して、どのミックスがお使いの qPCR マシンに最適かを判断できます。

ROX とは何ですか? それは必要ですか？

ROX はパッシブリファレンス色素であり、PCR 反応には関与しません。PCR に関連しない蛍光の変動を標準化するために使用されます。「リソース」セクションの qPCR 選択ツールを使用して、どの qPCR ミックスがお使いの qPCR マシンに最適かを判断できます。

反応が阻害された場合はどうすればよいですか？

阻害が見られる場合、反応中のテンプレートの量を減らすことができます。これにより Ct 値は増加しますが、Taq DNA ポリメラーゼの活性を阻害する阻害剤の可能性は低くなります。これが機能しない場合は、反応に 0.4～4 mg/ml の BSA を追加してみてください[1],[2]。製品マニュアルのサイクリング条件が遵守されていることを確認してください。

1. Kreader, C. A. Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein. Appl Environ Microbiol 62, 1102-1106 (1996).
2. Wilson, I. G. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification. Appl Environ Microbiol 63, 3741-3751 (1997).

段階希釈により増幅効率が低下した場合はどうすればよいでしょうか？

標準曲線をその後希釈すると効率が低下する可能性があることが報告されています。これを回避するには、標準を 10 mM Tris-HCl pH 8.0、0.1 mM EDTA、0.05% Tween-20 で希釈することをお勧めします。EDTA はキレート剤で、DNAse 活性を防ぐ役割を果たします[1]。Tween-20 は界面活性剤であり、DNA がチューブの側面に吸着するのを防ぎます [2]。ほとんどのマイクロ遠心分離機はポリプロピレン製で、DNA はポリプロピレンに非常によく付着することが研究で実証されています[3]。

標準は希釈後に凍結しないでください。界面活性剤の存在下であっても、凍結により DNA がポリプロピレンに不可逆的に結合するようです。標準は 4°C で保存し、数週間ごとに新しいバッチを準備することをお勧めします。

1. Barra, G. B. et al. EDTA-mediated inhibition of DNases protects circulating cell-free DNA from ex vivo degradation in blood samples. Clin Biochem 48, 976-981, doi:10.1016/j.clinbiochem.2015.02.014 (2015).
2. Linnarsson, S. Recent advances in DNA sequencing methods – general principles of sample preparation. Exp Cell Res 316, 1339-1343, doi:10.1016/j.yexcr.2010.02.036 (2010).
3. Gaillard, C. & Strauss, F. Avoiding adsorption of DNA to polypropylene tubes and denaturation of short DNA fragments. Technical Tips Online 3, 3 (1998).

qPCR に非特異的な生成物が含まれている場合、どのようなトラブルシューティングが推奨されますか？

反応を最適化する際に考慮すべきさまざまなオプションがあります。

• アニーリング/伸長時間を5秒に短縮する
• アニーリング/伸長温度を60℃から65℃に上げる

DNA テンプレートを希釈するには、まず 5 ng の DNA から始めて、10 倍のテンプレート希釈シリーズを使用します。これらを電気泳動にて非特異的な産物が残っているかどうかを確認するだけでなく、テンプレート希釈を行った後、qPCR 機器のソフトウェアを使用して反応の効率を計算することもできます。効率が 90 ～ 110% の場合、アンプリコンはサイクルごとに 2 倍になっています。

Ct 値が通常よりも高い場合、どのようなトラブルシューティングが推奨されますか？

一般に、Ct 値が高いことは、増幅が遅延していることを示します。これは、反応中のテンプレートが過剰で、プライマーとプローブが異なる DNA 分子に結合していることが原因である可能性が最も高いと考えられます。サンプルには通常、ターゲット遺伝子以外の DNA が多く含まれており、オリゴが散乱する可能性があります。この問題を解決するには、サンプルを希釈 (10 倍～1000 倍) することをお勧めします。

さらに、アニーリング/伸長温度を上げて、オリゴの結合を標的配列により特異的にし、バックグラウンドシグナルを減少させることもできます。

マルチプレックスを実行する場合、各プライマーの推奨濃度はどれくらいですか？

各プライマーを 0.4 µM で使用することをお勧めします。この推奨濃度にはある程度の柔軟性がありますが、プライマー濃度を上げないでください。酵素の活性に重大な影響を与える可能性があります。

マルチプレックス化に関する詳細な考慮事項については、qPCR テクニカル ガイドを参照してください。

競合他社の製品と同じプライマーと PCR 条件を使用しているのに、非特異的な生成物が存在するのはなぜですか？

おそらく、最初のステップ (ホット スタート) の時間が短すぎることが原因です。酵素を完全に活性化させるために、ホット スタート フェーズを 95°C で 2 分間実行するようにしてください。推奨される温度プロファイルは次のとおりです。

• 95°C (120 seconds)
• 40 cycles: 95°C (5-15 seconds) – 60°C (20-30 seconds)
• Melt

それでも非特異的な生成物が得られる場合、使用するプライマー セットに応じて、アニーリング/伸長温度を 60°C から 65°C に上げることをお勧めします。