Clara® Probe 1-Step Purple Mix は、サンプルを視覚化するための見やすい不活性紫色色素を使用しており、毎回明確で一貫した結果を提供します。この新しいシングルチューブ RT-qPCR ミックスは、シングルおよびマルチプレックス アッセイでの RNA および DNA ターゲットのユニバーサル プローブ ベースの検出に適しています。

Clara® Probe 1-Step Purple Mix は、診断アプリケーションや基礎研究において、最高の感度、信頼性、使いやすさを備えた qPCR および 1 ステップ RT-qPCR を実現します。これは、TaqMan、Scorpions®、モレキュラービーコンなど、あらゆる種類のプローブ技術に適したユニバーサル qPCR ミックスです。これは、DNA ポリメラーゼと逆転写酵素の両方が同じマスターミックスに含まれている、PCR BioSystems 社の第一世代のオールインワン 1 ステップ RT-qPCR ミックスです。Clara® Probe 1-Step Purple Mix は、当社独自のホット スタート Taq DNA ポリメラーゼと、高性能で耐熱性のある UltraScript® 逆転写酵素の特別に改良されたバージョンを搭載しています。開発中に厳密なテストを行った結果、このミックスは、1 つのターゲットを検出する場合でも、同時に複数のターゲットを検出する場合でも、高効率で高感度な検出で、単一検出と多重検出の両方に非常に適しています。

このミックスは、融解曲線分析（ハイブリダイゼーション プローブのみ）にも適しており、パッシブリファレンス色素なし（No-Rox）またはパッシブリファレンス色素あり（Lo-ROX、Hi-Rox、Separate-ROX、AquaPlex 配合）でご利用いただけます。qPCR 選択ツールを使用して、どの ROX バリアントがお使いの機器と互換性があるかを確認してください。

Clara® Probe 1-Step Purple Mix は、Clara®試薬ファミリーのスピード、感度、特異性と、サンプルの視覚化を容易にする不活性紫色色素を組み合わせたものです。この染料はプローブ蛍光体の消光を大幅に低減し、qPCRの正確な結果を保証すると同時に、取り扱いやピペッティングの手間を軽減します。

Clara® Probe 1-Step Purple Mixes のプローブの蛍光強度が減少します。

• FAM: up to 25%
• HEX: up to 30%
• Tex: up to 25%
• Cy5: up to 10%

パーセンテージは、少なくとも 2 つの異なる反応におけるプラトーの高さの減少 (Purple Mix と Basic Mix の比較) を表します。

PCR Biosystems 社独自のバッファー組成 (スマート スクリーン技術で識別) と独自に改良された UltraScript® 逆転写酵素により、オールインワンの RT-qPCR マスターミックスとして、ミックスを 1 本のチューブに保存できます。これにより、アッセイのセットアップに必要なピペッティングの回数が減り、汚染のリスクが最小限に抑えられ、時間が節約されます。また、1 つの試薬が DNA と RNA の増幅に適しており、両方のターゲット タイプを同じプレートまたは同じ実行に含めることができることも意味します。ミックスが 1 つあるということは、主に RNA ターゲットを調査しているが DNA 定量化も必要な場合に、別のセットアップが必要ないことを意味します。

両方のターゲット タイプを大量にテストするお客様は、ターゲット タイプごとに専用の試薬を好むかもしれませんが、Clara® Probe Purple Mix は DNA および cDNA プローブベースの検出専用に開発されています。

徹底的な最適化により、このミックスはあらゆるタイプの核酸ターゲットに適しています。SARS-CoV-2、RSV、インフルエンザA、Bなどの一般的なRNAウイルス、g-アクチン や GAPDHなどの標準的なハウスキーピング遺伝子、およびDNAターゲットに対してテスト済みです。ミックスに逆転写酵素が含まれていてもDNAターゲットの直接増幅には影響しません。つまり、DNAまたはRNA配列の検出で同じ高い効率が得られます。ミックスは非常に安定しており、実行間で高い再現性を示し、データの再現性と実験結果の信頼性を高めます。

Clara® Probe 1-Step Purple Mix の高濃度 4x ミックス形式は、各反応により多くのサンプルを追加し、より少ない反応容量を安心して使用できるため、感度と柔軟性が向上します。高速増幅により Cts が早くなり、20 μL 反応あたり 4 つのターゲット コピー (μL あたり 0.8 コピー) まで確実に検出できます。最も希薄なサンプルであっても優れた検出を実現します。

プライマーとプローブは慎重に設計してください。高速サイクリング条件下での効率的な増幅のために、80 bp ～ 200 bp のアンプリコン長をお勧めします。すべてのメーカーのマスター ミックスで、アンプリコン長が短いほど、反応を速くサイクリングできます。アンプリコン長は 400 bp を超えてはなりません。プライマーは、デフォルトの Primer 3 設定を使用した場合、約 60 °C の融解温度が予測されます。TaqMan® プローブの場合、5′ プライマーに近いプローブを選択し、末端グアノシン残基は避けてください。特にマルチプレックス反応では、プローブ色素とクエンチャーの理想的な組み合わせを確保してください。

qPCR 実験の設計方法と qPCR 結果の分析方法の詳細については、qPCR テクニカル ガイドを参照してください。

マウス RNA によるシングルプレックス感度。Clara® Probe 1-Step Mix を使用したシングルプレックス設定での一般的なハウスキーピング遺伝子 (βアクチンおよび β -2-ミクログロブリン [B2M]) の増幅。増幅曲線は左のパネルに、効率は右のパネルに示されています。マウスの全 RNA テンプレートの 5 つの連続希釈液を使用しました。それぞれ 50 ng/µL、5 ng/µl、500 pg/µL、50 pg/µL、5 pg/µL に相当します。総反応容量は 20 µL でした。サイクル条件は、52℃ 5 分、95℃ 3 分、および 95℃ 15 秒、60℃ 30 秒の 60 サイクルでした。Clara® Probe 1-Step Mix は、テンプレートの濃度が低くても、高い感度と再現性のある増幅を示し、最大限の効率を示します。

Clara® Probe 1-Step Mix (ピンク色のバー)、Thermo Fisher SuperScript III Platinum OneStep qRT-PCR Kit (緑色のバー)、Thermo Fisher TaqPath 1-Step Multiplex Mastermix (青色のバー)、および NEB Luna Universal Probe One-Step RY-qPCT Kit (黄色のバー) を使用した、一般的な冬のウイルス (インフルエンザ A、インフルエンザ B、RS ウイルス、および SARS-CoV-2) のマルチプレックス増幅。Ct 値は上のパネルに、効率は下のパネルに示されています。RNA テンプレートの 5 段階希釈液が使用されました。これは、各ウイルスゲノムの 40,000、4,000、400、40、および 4 コピーに相当します。総反応容量は 20 µL でした。サイクル条件は、52℃ 15 分、95℃ 3 分、95℃ 15 秒、60℃ 30 秒の 50 サイクルでした。Clara® Probe 1-Step Mix は、マルチプレックス設定で最適な効率で、低コピー数のテンプレートでも高感度で再現性の高い増幅を示し、主要な Probe 1-Step Mix の競合製品と同等かそれ以上です。

Clara® Probe 1-Step Purple Mix Lo-ROX

Clara® Probe 1-Step Purple Mix Hi-ROX

Clala® Probe 1-Step Purple Mix No-ROX

Clara® Probe 1-Step Purple Mix Separate-ROX

Clara® Probe 1-Step Mix AquaPlex

Clara® Probe 1-Step Mix と Purple Mix は、1 ステップ RT-PCR と 2 ステップ RT-PCR の両方に使用できますか？

はい。Clara® Probe 1-Step Mix は、cDNA と RNA ターゲットを同様に増幅できます。ただし、このミックスは逆転写酵素を含んでいるため、1 ステップ ワークフローに最適です。1 ステップ ワークフローや、限られた数のサンプルで DNA 検出が必要な実験には Clara® Probe 1-Step Mix を使用し、2 ステップ プロトコルや通常の DNA 検出には Clara® Probe Mix を使用することをお勧めします。

Clara® および Clara® Purple ミックスで生成された製品は、消化、クローン化、および配列決定できますか？

はい、これらのミックスで生成された PCR 産物は、野生型 Taq ポリメラーゼで生成された PCR 産物と同じ特性を持っています。標準プロトコルを使用して、制限エンドヌクレアーゼで配列決定または消化することができます。産物は 3′-d(A) 末端で、TA クローニングに使用できます。または、クローニング前に平滑末端にしたり、制限酵素で消化したりすることもできます。最良の結果を得るには、標準的な PCR クリーンアップ キットを使用して PCR 産物を精製することをお勧めします。

Clara® Probe Mix および Clara® Probe 1-Step Mix には FAM 色素が含まれていますか？

いいえ。ROX（キットに含まれている場合）以外に、PCR Biosystems 社のミックスには他の色素は含まれていません。したがって、反応には任意の蛍光体結合プローブを使用できます。

Clara® Probe Mix および Clara® Probe 1-Step Mix の蛍光が競合他社の製品で得られる蛍光と異なるのは正常ですか？

製品によって蛍光のプラトーが異なる場合があります。ただし、これは定量化の精度には影響せず、Ct 値は製品間で異なりません。

1x TE (10 mM Tris-HCl / 1 mM EDTA) バッファーでのサンプル DNA の保存は、Clara® Probe Mix および Clara® Probe 1-Step Mix を使用した後続の qPCR と互換性がありますか？

はい、この保存バッファーは互換性があります。EDTA は混合物中のマグネシウムの一部をキレート化しますが、反応に大きく影響するほどではありません。

Clara® Probe Mix、Clara® Probe 1-Step Mix、および各 Purple Mix の ROX 濃度はどれくらいですか？

パッシブリファレンス色素を含む Clara® Probe Purple および Clara® Probe 1-Step Purple Mix は、異なる配合で提供され、それぞれ異なる濃度のパッシブリファレンス色素を含んでいます。

• Lo-ROX Mix には 200 nM ROX が含まれています
• Hi-ROX Mix には 2 µM ROX が含まれています
• No-ROX Mix には ROX が含まれていません

Separate-ROX Mix には、50 µM ROX 添加剤の別のチューブが含まれています。これにより、使用する ROX の濃度を選択できます。 qPCR 選択ツールを使用して、どのミックスがお使いの qPCR マシンに最適かを判断できます。

qPCR に非特異的な生成物が含まれている場合、どのようなトラブルシューティングが推奨されますか？

反応を最適化する際に考慮すべきさまざまなオプションがあります。

• アニーリング/伸長時間を5秒に短縮する
• アニーリング/伸長温度を60℃から65℃に上げる

DNA テンプレートを希釈するには、まず 5 ng の DNA から始めて、10 倍のテンプレート希釈シリーズを使用します。これらを電気泳動にて非特異的な産物が残っているかどうかを確認するだけでなく、テンプレート希釈を行った後、qPCR 機器のソフトウェアを使用して反応の効率を計算することもできます。効率が 90 ～ 110% の場合、アンプリコンはサイクルごとに 2 倍になっています。

このミックスはマイクロ RNA テンプレートに使用できますか？

はい、Clara® Probe 1-Step Mix はマイクロ RNA テンプレートに使用できます。専用のキットは販売していませんが、PCR Biosystems 社の逆転写酵素はすべて miRNA の定量化と分析に使用できます。

次の 2 つのアプローチのいずれかをお勧めします。

• ユニバーサル RT プライマーを使用して、ポリ (A) またはポリ (U) テールを追加し (例: ポリ (U) ポリメラーゼによる)、続いてユニバーサルプライマーを使用して cDNA を合成します。[1], [2]
• 特定の RT プライマーを使用し、テーリング ステップ を省略します。[1],[3]-[5]

これらのアプローチの詳細がよくわからない場合は、ガイドラインとして以下のリストを参照してください。

1. Dave, V. P. et al. MicroRNA amplification and detection technologies: opportunities and challenges for point of care diagnostics. Lab Invest 99, 452-469, doi:10.1038/s41374-018-0143-3 (2019).
2. Mei, Q. et al. A facile and specific assay for quantifying microRNA by an optimized RT-qPCR approach. PLoS One 7, e46890, doi:10.1371/journal.pone.0046890 (2012).
3. Chen, C. et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res 33, e179, doi:10.1093/nar/gni178 (2005).
4. Raymond, C. K., Roberts, B. S., Garrett-Engele, P., Lim, L. P. & Johnson, J. M. Simple, quantitative primer-extension PCR assay for direct monitoring of microRNAs and short-interfering RNAs. RNA 11, 1737-1744, doi:10.1261/rna.2148705 (2005).
5. Androvic, P., Valihrach, L., Elling, J., Sjoback, R. & Kubista, M. Two-tailed RT-qPCR: a novel method for highly accurate miRNA quantification. Nucleic Acids Res 45, e144, doi:10.1093/nar/gkx588 (2017).