RT-qPCR はもはや難しいことではありません。Clara® Probe 1-Step Mix を使用すると、毎回明確で一貫した結果が得られます。この新しいシングルチューブ RT-qPCR ミックスは、シングルおよびマルチプレックス アッセイにおける RNA および DNA ターゲットのユニバーサル プローブベースの検出に適しています。

Clara® Probe 1-Step Mix は、診断アプリケーションや基礎研究において、最高の感度、信頼性、使いやすさを備えた qPCR および 1 ステップ RT-qPCR を実現します。これは、TaqMan、Scorpions、分子ビーコンなど、あらゆる種類のプローブ技術に適したユニバーサル qPCR ミックスです。これは、DNA ポリメラーゼと逆転写酵素の両方が同じマスターミックスに含まれている、当社の第一世代のオールインワン 1 ステップ RT-qPCR ミックスです。Clara® Probe 1-Step Mix は、PCR BioSystems 社独自のホット スタート Taq DNA ポリメラーゼと、高性能で耐熱性のある UltraScript® 逆転写酵素の特別に改良されたバージョンを搭載しています。開発中に厳密なテストを行った結果、このミックスは、1 つのターゲットを検出する場合でも、同時に複数のターゲットを検出する場合でも、高効率で高感度な検出で、単一検出と多重検出の両方に非常に適しています。

このミックスは、融解曲線分析（ハイブリダイゼーション プローブのみ）にも適しており、パッシブ参照色素なし（No-Rox）または参照色素あり（Lo-ROX、Hi-Rox、Separate-ROX、AquaPlex 配合）でご利用いただけます。qPCR 選択ツールを使用して、どの ROX バリアントがお使いの機器と互換性があるかを確認してください。

AquaPlex フォーマットは、赤色 (Cy5、650 nm) チャネルでの検出に適したパッシブリファレンス色素を使用して設計されており、通常 ROX 検出に使用されるチャネルでモニタリングできるプローブ色素の使用を可能にします。これにより、マルチプレックス アッセイでより最適な信号生成とより高品質なデータが可能になります。

当社独自のバッファー組成 (スマート スクリーン技術で識別) と独自に改良された UltraScript® RTase により、オールインワンの RT-qPCR マスターミックスとして、ミックスを 1 本のチューブに保存できます。これにより、アッセイのセットアップに必要なピペッティングの回数が減り、汚染のリスクが最小限に抑えられ、時間が節約されます。また、1 つの試薬が DNA と RNA の増幅に適しており、両方のターゲット タイプを同じプレートまたは同じ実行に含めることができることも意味します。ミックスが 1 つあるということは、主に RNA ターゲットを調査しているが、DNA 定量化も必要な場合に、別のセットアップが必要ないことを意味します。

両方のターゲット タイプを大量にテストするお客様は、ターゲット タイプごとに専用の試薬を好むかもしれませんが、Clara® Probe Mix は DNA および cDNA プローブ ベースの検出専用に開発されています。

徹底的な最適化により、このミックスはあらゆるタイプの核酸ターゲットに適しています。SARS-CoV-2、RSV、インフルエンザA、Bなどの一般的なRNAウイルス、g-アクチンやGAPDHなどの標準的なハウスキーピング遺伝子、およびDNAターゲットに対してテストしました。ミックスにRTaseが含まれていてもDNAターゲットの直接増幅には影響しません。つまり、DNAまたはRNA配列の検出で同じ高い効率が得られます。ミックスは非常に安定しており、実行間で高い再現性を示し、データの再現性と導き出した実験結果の信頼性を高めます。

Clara® Probe 1-Step Mix の高濃度 4x ミックス形式は、各反応により多くのサンプルを追加し、より少ない反応容量を安心して使用できるため、感度と柔軟性が向上します。高速増幅により Cts が早くなり、20 μL 反応あたり 4 つのターゲット コピー (μL あたり 0.8 コピー) まで確実に検出できます。最も希薄なサンプルであっても優れた検出を実現します。

マウス RNA によるシングルプレックス感度。Cara Probe 1-Step Mix を使用したシングルプレックス設定での一般的なハウスキーピング遺伝子 (βアクチンおよび β -2-ミクログロブリン [B2M]) の増幅。増幅曲線は左のパネルに、効率は右のパネルに示されています。マウスの全 RNA テンプレートの 5 つの連続希釈液を使用しました。それぞれ 50 ng/µL、5 ng/µl、500 pg/µL、50 pg/µL、5 pg/µL に相当します。総反応容量は 20 µL でした。サイクル条件は、52℃ 5 分、95℃ 3 分、および 95℃ 15 秒、60℃ 30 秒の 60 サイクルでした。Clara Probe 1-Step Mix は、テンプレートの濃度が低くても、高い感度と再現性のある増幅を示し、最大限の効率を示します。

Clara Probe 1-Step Mix を使用したシングルプレックス設定での一般的なハウスキーピング遺伝子 (ベータ 2 ミクログロブリン [B2M]) の増幅。増幅曲線を左のパネルに示し、効率を右のパネルに示します。マウス cDNA テンプレートの 5 つの連続希釈液を使用しました。これは、1 ng/μL、100 pg/μL、1 pg/μL、および 0.1 pg/μL (B2M の場合) に相当します。総反応容量は 20 μL でした。サイクル条件は、95℃ 2 分および 95℃ 10 秒、60℃ 30 秒の 60 サイクルでした。Clara Probe 1-Step Mix は、DNA ターゲットに対しても最適な効率で、テンプレート濃度が低い場合でも高感度で再現性の高い増幅を示します。

Clara Probe 1-Step Mix (ピンク色のバー)、Thermo Fisher SuperScript III Platinum OneStep qRT-PCR Kit (緑色のバー)、Thermo Fisher TaqPath 1-Step Multiplex Mastermix (青色のバー)、および NEB Luna Universal Probe One-Step RY-qPCT Kit (黄色のバー) を使用した、一般的な冬のウイルス (インフルエンザ A、インフルエンザ B、RS ウイルス、および SARS-CoV-2) のマルチプレックス増幅。Ct 値は上のパネルに、効率は下のパネルに示されています。RNA テンプレートの 5 段階希釈液が使用されました。これは、各ウイルスゲノムの 40,000、4,000、400、40、および 4 コピーに相当します。総反応容量は 20 µL でした。サイクル条件は、52℃ 15 分、95℃ 3 分、95℃ 15 秒、60℃ 30 秒の 50 サイクルでした。Clara Probe 1-Step Mix は、マルチプレックス設定で最適な効率で、低コピー数のテンプレートでも高感度で再現性の高い増幅を示し、主要な Probe 1-Step Mix の競合製品と同等かそれ以上です。

Clara® Probe 1-Step Mix Lo-ROX

Clara® Probe 1-Step Mix Hi-ROX

Clala® Probe 1-Step Mix No-ROX

Clara® Probe 1-Step Mix Separate-ROX

Clara® Probe 1-Step Mix AquaPlex

Ct 値がどれくらいの値を超えると結果は信頼できなくなりますか？

Ct 値はテンプレート濃度、反応の最適化、機器、研究室によって異なるため、カットオフ Ct 値を選択する際には注意が必要です。一般的に、35 ～ 40 を超える Ct 値は信頼できないと見なされ始めます。ただし、テンプレートのコピー数が少ない場合、反応が非効率的になると Ct が遅くなることがあります。相対的または絶対的な定量化方法を使用してカットオフを標準化することは常に良い方法です。また、遅く増幅された生成物を特定するために、生成物の融解曲線または電気泳動を実行して分析することをお勧めします。

Clara® Probe 1-Step Mix と Purple Mix は、1 ステップ RT-PCR と 2 ステップ RT-PCR の両方に使用できますか？

はい。Clara® Probe 1-Step Mix は、cDNA と RNA ターゲットを同様に増幅できます。ただし、このミックスは RTase を含んでいるため、1 ステップ ワークフローに最適です。1 ステップ ワークフローや、限られた数のサンプルで DNA 検出が必要な実験には Clara® Probe 1-Step Mix を使用し、2 ステップ プロトコルや通常の DNA 検出には Clara® Probe Mix を使用することをお勧めします。

Clara® および Clara® Purple ミックスで生成された製品は、消化、クローン化、および配列決定できますか？

はい、これらのミックスで生成された PCR 産物は、野生型 Taq ポリメラーゼで生成された PCR 産物と同じ特性を持っています。標準プロトコルを使用して、制限エンドヌクレアーゼで配列決定または消化することができます。産物は 3′-d(A) 末端で、TA クローニングに使用できます。または、クローニング前に平滑末端にしたり、制限酵素で消化したりすることもできます。最良の結果を得るには、標準的な PCR クリーンアップ キットを使用して PCR 産物を精製することをお勧めします。

ROX は反応に悪影響を及ぼす可能性がありますか？

ROX (6-carboxy-X-rhodamine) は、主にウェル間の光路のばらつきによって生じる蛍光レベルの変動を正規化するために、ROX 依存型リアルタイム PCR 機器でパッシブ リファレンス 色素として使用されます。蛍光強度 (Rn) の正規化は、リアルタイム PCR ソフトウェアで、特定の信号の発光強度を ROX の発光強度で割ることによって行われます。

ROX は PCR 反応には関与せず、その蛍光レベルは各ウェルの DNA の量に比例しないため、この蛍光体を混合物に追加すると、増幅中に一定の蛍光信号が得られます。

パッシブ リファレンス スタンダードを必要とするさまざまなタイプのリアルタイム PCR 機器では、主に各システムの光学構成 (つまり、使用される励起源と光学系の種類) が異なるため、ROX の最適濃度が異なります。

ROX の添加量が少なすぎたり多すぎたりすると、非常にノイズの多い信号になり反応の結果に影響を及ぼすため、お客様にとって次のことが非常に重要です:

1. リアルタイム PCR の結果を最適化するために適切な ROX 濃度を決定する
2. 反応を設定するために使用するソフトウェアで ROX 設定を確認する

最も一般的に使用されるシステム用の便利な選択ツールは、こちらにあります。

Clara® Probe Mix および Clara® Probe 1-Step Mix には FAM 色素が含まれていますか？

いいえ。ROX（キットに含まれている場合）以外に、PCR Biosystems 社のミックスには他の色素は含まれていません。したがって、反応には任意の蛍光体結合プローブを使用できます。

反応中に RNase 阻害剤を使用する必要はありますか？

いいえ、ミックスには劣化を防ぎ感度を高めるための RNase 阻害剤が含まれています。

Clara® Probe Mix および Clara® Probe 1-Step Mix の蛍光が競合他社の製品で得られる蛍光と異なるのは正常ですか？

製品によって蛍光のプラトーが異なる場合があります。ただし、これは定量化の精度には影響せず、Ct 値は製品間で異なりません。

1x TE (10 mM Tris-HCl / 1 mM EDTA) バッファーでのサンプル DNA の保存は、Clara® Probe Mix および Clara® Probe 1-Step Mix を使用した後続の qPCR と互換性がありますか？

はい、この保存バッファーは互換性があります。EDTA は混合物中のマグネシウムの一部をキレート化しますが、反応に大きく影響するほどではありません。

Clara® Probe Mix、Clara® Probe 1-Step Mix、および各 Purple Mix の ROX 濃度はどれくらいですか？

パッシブリファレンス色素を含む Clara® Probe Purple および Clara® Probe 1-Step Purple Mix は、異なる配合で提供され、それぞれ異なる濃度のパッシブリファレンス色素を含んでいます。

・Lo-ROX Mix には 200 nM ROX が含まれています
・Hi-ROX Mix には 2 µM ROX が含まれています
・No-ROX Mix には ROX が含まれていません

Separate-ROX Mix には、50 µM ROX 添加剤の別のチューブが含まれています。これにより、使用する ROX の濃度を選択できます。 qPCR 選択ツールを使用して、どのミックスがお使いの qPCR マシンに最適かを判断できます。

ROX とは何ですか? それは必要ですか？

ROX はパッシブリファレンス色素であり、PCR 反応には関与しません。PCR に関連しない蛍光の変動を標準化するために使用されます。「リソース」セクションの qPCR 選択ツールを使用して、どの qPCR ミックスがお使いの qPCR マシンに最適かを判断できます。

反応が阻害された場合はどうすればよいですか？

阻害が見られる場合、反応中のテンプレートの量を減らすことができます。これにより Ct 値は増加しますが、Taq DNA ポリメラーゼの活性を阻害する阻害剤の可能性は低くなります。これが機能しない場合は、反応に 0.4～4 mg/ml の BSA を追加してみてください[1],[2]。製品マニュアルのサイクリング条件が遵守されていることを確認してください。

1. Kreader, C. A. Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein. Appl Environ Microbiol 62, 1102-1106 (1996).
2. Wilson, I. G. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification. Appl Environ Microbiol 63, 3741-3751 (1997).

段階希釈により増幅効率が低下した場合はどうすればよいでしょうか？

標準曲線をその後希釈すると効率が低下する可能性があることが報告されています。これを回避するには、標準を 10 mM Tris-HCl pH 8.0、0.1 mM EDTA、0.05% Tween-20 で希釈することをお勧めします。EDTA はキレート剤で、DNAse 活性を防ぐ役割を果たします[1]。Tween-20 は界面活性剤であり、DNA がチューブの側面に吸着するのを防ぎます [2]。ほとんどのマイクロ遠心分離機はポリプロピレン製で、DNA はポリプロピレンに非常によく付着することが研究で実証されています[3]。

標準は希釈後に凍結しないでください。界面活性剤の存在下であっても、凍結により DNA がポリプロピレンに不可逆的に結合するようです。標準は 4°C で保存し、数週間ごとに新しいバッチを準備することをお勧めします。

1. Barra, G. B. et al. EDTA-mediated inhibition of DNases protects circulating cell-free DNA from ex vivo degradation in blood samples. Clin Biochem 48, 976-981, doi:10.1016/j.clinbiochem.2015.02.014 (2015).
2. Linnarsson, S. Recent advances in DNA sequencing methods – general principles of sample preparation. Exp Cell Res 316, 1339-1343, doi:10.1016/j.yexcr.2010.02.036 (2010).
3. Gaillard, C. & Strauss, F. Avoiding adsorption of DNA to polypropylene tubes and denaturation of short DNA fragments. Technical Tips Online 3, 3 (1998).

qPCR に非特異的な生成物が含まれている場合、どのようなトラブルシューティングが推奨されますか？

反応を最適化する際に考慮すべきさまざまなオプションがあります。

• アニーリング/伸長時間を5秒に短縮する
• アニーリング/伸長温度を60℃から65℃に上げる

DNA テンプレートを希釈するには、まず 5 ng の DNA から始めて、10 倍のテンプレート希釈シリーズを使用します。これらを電気泳動にて非特異的な産物が残っているかどうかを確認するだけでなく、テンプレート希釈を行った後、qPCR 機器のソフトウェアを使用して反応の効率を計算することもできます。効率が 90 ～ 110% の場合、アンプリコンはサイクルごとに 2 倍になっています。

Ct 値が通常よりも高い場合、どのようなトラブルシューティングが推奨されますか？

一般に、Ct 値が高いことは、増幅が遅延していることを示します。これは、反応中のテンプレートが過剰で、プライマーとプローブが異なる DNA 分子に結合していることが原因である可能性が最も高いと考えられます。サンプルには通常、ターゲット遺伝子以外の DNA が多く含まれており、オリゴが散乱する可能性があります。この問題を解決するには、サンプルを希釈 (10 倍～1000 倍) することをお勧めします。

さらに、アニーリング/伸長温度を上げて、オリゴの結合を標的配列により特異的にし、バックグラウンドシグナルを減少させることもできます。

マルチプレックスを実行する場合、各プライマーの推奨濃度はどれくらいですか？

各プライマーを 0.4 µM で使用することをお勧めします。この推奨濃度にはある程度の柔軟性がありますが、プライマー濃度を上げないでください。酵素の活性に重大な影響を与える可能性があります。

マルチプレックス化に関する詳細な考慮事項については、qPCR テクニカル ガイドを参照してください。

競合他社の製品と同じプライマーと PCR 条件を使用しているのに、非特異的な生成物が存在するのはなぜですか？

おそらく、最初のステップ (ホット スタート) の時間が短すぎることが原因です。酵素を完全に活性化させるために、ホット スタート フェーズを 95°C で 2 分間実行するようにしてください。推奨される温度プロファイルは次のとおりです。

• 95°C (120 seconds)
• 40 cycles: 95°C (5-15 seconds) – 60°C (20-30 seconds)
• Melt

それでも非特異的な生成物が得られる場合、使用するプライマー セットに応じて、アニーリング/伸長温度を 60°C から 65°C に上げることをお勧めします。

このミックスはマイクロ RNA テンプレートに使用できますか？

はい、Clara® Probe 1-Step Mix はマイクロ RNA テンプレートに使用できます。専用のキットは販売していませんが、当社の RTase はすべて miRNA の定量化と分析に使用できます。

次の 2 つのアプローチのいずれかをお勧めします。

• ユニバーサル RT プライマーを使用して、ポリ (A) またはポリ (U) テールを追加し (例: ポリ (U) ポリメラーゼによる)、続いてユニバーサルプライマーを使用して cDNA を合成します。[1], [2]
• 特定の RT プライマーを使用し、テーリング ステップ を省略します。[1],[3]-[5]

これらのアプローチの詳細がよくわからない場合は、ガイドラインとして以下のリストを参照してください。

1. Dave, V. P. et al. MicroRNA amplification and detection technologies: opportunities and challenges for point of care diagnostics. Lab Invest 99, 452-469, doi:10.1038/s41374-018-0143-3 (2019).
2. Mei, Q. et al. A facile and specific assay for quantifying microRNA by an optimized RT-qPCR approach. PLoS One 7, e46890, doi:10.1371/journal.pone.0046890 (2012).
3. Chen, C. et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res 33, e179, doi:10.1093/nar/gni178 (2005).
4. Raymond, C. K., Roberts, B. S., Garrett-Engele, P., Lim, L. P. & Johnson, J. M. Simple, quantitative primer-extension PCR assay for direct monitoring of microRNAs and short-interfering RNAs. RNA 11, 1737-1744, doi:10.1261/rna.2148705 (2005).
5. Androvic, P., Valihrach, L., Elling, J., Sjoback, R. & Kubista, M. Two-tailed RT-qPCR: a novel method for highly accurate miRNA quantification. Nucleic Acids Res 45, e144, doi:10.1093/nar/gkx588 (2017).