Clara® Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mix は、プローブベースの 1 ステップ RT-qPCR 用の広域スペクトルの阻害剤耐性 4x ミックスを提供します。

PCR および qPCR は、さまざまな化合物によって阻害され、qPCR ワークフローおよび診断プロセスに悪影響を及ぼす可能性があります。Clara® Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mix は、DNA ポリメラーゼ、逆転写酵素 (RTase)、RNase 阻害剤、緩衝剤、マグネシウム、dNTP、およびプローブベースの (RT-)qPCR を成功させるために必要なその他のコンポーネントがすべて 1 つのチューブ フォーマットに含まれた 4x レディミックスです。お客様は、このミックスをプライマー、プローブ、およびテンプレートと組み合わせて、シングルまたはマルチプレックス検出を行うことができます。このミックスは、TaqMan、Scorpions、および分子ビーコンを含むすべてのプローブ化学と普遍的に互換性があり、すべての市販のリアルタイム PCR 機器と最大限の互換性があります。Clara® Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mix は、体外診断 (IVD) キット開発用に設計されており、効率的で信頼性の高い (RT-)qPCR 反応を必要とするさまざまな研究アプリケーションにも使用できます。

1 ステップ ミックスは、テンプレートの種類に関係なく、効率を損なうことなく DNA と RNA の両方のサンプルを増幅するために使用できます。Clara® Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mixは、粗唾液検査での使用に特化して設計されていますが、さまざまな臨床および研究室由来の qPCR 阻害剤にも耐性があります。

Clara® Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mixは、標準的な実験室化学物質 (SDS、グアニジン、エタノール) や、血液サンプル (ヘミン、ヘマチン、ヘモグロビン、ヘパリン、IgG 免疫グロブリン、ラクトフェリン、クエン酸ナトリウム)、唾液、尿 (尿素)、植物、環境サンプル (フミン酸、カテキン、ケルセチン、タンニン酸、セルロース、クロロフィル) に含まれる生物学的サンプル阻害剤など、広範囲の一般的な PCR 阻害剤に対してテストされ、耐性があります。このミックスは、粗 (または希釈) 唾液と血液、および他の複数の純粋な化学阻害剤に対して広範囲に検証されています。

4 つの RNA ターゲット、SARS-CoV-2 E 遺伝子 (E 遺伝子)、呼吸器合胞体ウイルス (RSV)、インフルエンザ A (INF-A)、インフルエンザ B (INF-B) を、ヒト唾液の存在下 (紫) と非存在下 (青) で、Clara® Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mix を使用したマルチプレックス 1 ステップ RT-qPCR 反応で増幅しました。各ターゲットに対して 3 つのテクニカルレプリケートを含む 4 つのテンプレート希釈度 (4000、400、40、4 コピー) が 20 μL 反応で使用されました。唾液を使用した反応には、ユニバーサル輸送培地で 1/10 に希釈された 5 μL の唾液が含まれ、これは反応あたり 2.5% のヒト唾液に相当します。サイクル条件は、47 °C で 10 分、95 °C で 2 分、続いて 95 °C で 10 秒、60 °C で 30 秒を 50 サイクルでした。Clara® Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mix は、ヒト唾液の存在下でもマルチプレックス設定で RNA ターゲットを正常に増幅します。

4 つの RNA ターゲット、SARS-CoV-2 E 遺伝子 (E 遺伝子)、呼吸器合胞体ウイルス (RSV)、インフルエンザ A (INF-A)、インフルエンザ B (INF-B) が、ヒト唾液の存在下で、Clara® Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mix (紫、PCRBIO)、Takara の One Step PrimeScript III RT-PCR Kit (灰色、Takara)、Air-Dryable Direct RNA/DNA qPCR Saliva (灰色、Meridian SR)、および Meridian の Inhibitor-Tolerant RT-qPCR Mix (灰色、Meridian IT) を使用したマルチプレックス 1 ステップ RT-qPCR 反応で増幅されました。各ターゲットに対して 3 つの技術的複製を含む 4 つのテンプレート希釈度 (4000、400、40、および 4 コピー) が 20 μL 反応で使用されました。唾液との反応には、ユニバーサル輸送培地で 1/10 に希釈された 5 μL の唾液が含まれており、これは反応あたり 2.5% のヒト唾液に相当します。Clara® Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mix は、ヒト唾液の存在下でのマルチプレックス設定において 3 つの競合製品と同等またはそれを上回るパフォーマンスを発揮します。

Clara® Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mix Lo-ROX

Clara® Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mix Hi-ROX

Clara® Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mix No-ROX

Clara® Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mix Separate-ROX

この組み合わせで高速サイクリングを行うことはできますか？

1 秒の変性と 3 秒のアニーリングおよび伸長 (2 段階サイクリング) を 40 サイクル使用することで、さまざまなターゲットの信頼性の高い増幅が実現しました。これらの条件下で増幅を成功させるには、適度に短いアンプリコンが必要であり、実験に追加されるすべての新しいターゲットについてケースバイケースでテストする必要があります。

この混合物に植物の粗抽出物を使用できますか？

結果は植物種と組織の種類によって異なります。当社の阻害剤耐性化学物質は、クロロフィルやカテキン、ケルセチンなどのポリフェノールに対して中程度の耐性を示しますが、タンニン酸、セルロース、ペクチンに対しては低い耐性を示します。したがって、希望するサンプルの種類で混合物をテストすることをお勧めします。すべての植物組織は、阻害剤耐性混合物を使用する前に、適切な抽出バッファーで機械的に溶解して細胞壁と膜を破壊する必要があります。対象サンプルの種類で少数の反応をテストすることをお勧めします。製品サンプルをリクエストする場合、またはこのようなテスト反応の計画にサポートが必要な場合は弊社までお問い合わせください。

1 回の反応あたりどのくらいの量の粗血液を追加できますか？

PCR BioSystems 社では、20 μL 反応あたり最大 5 μL の血液サンプル (1.25 μL の粗血液を NaCl/EDTA 溶液で 1:4 に希釈) に対して多重反応を実行することに成功しました。これにより全体的な蛍光は減少しますが、qPCR 反応自体が阻害されることはなく、混合物の感度も制限されません。

反応ごとにどれくらいの量の粗唾液を加えることができますか？

PCR BioSystems 社では、反応ごとに最大 10% の粗唾液のテストに成功し、2.5% の唾液を使用した場合に最良で最も一貫した結果が得られました。

粗製サンプルが存在する場合、Cq に多少の遅延が見られるのは正常ですか？

はい。ミックスは阻害剤耐性がありますが、阻害剤の存在に対して完全に耐性があるわけではありません。異なる阻害剤や高濃度は、qPCR 反応を阻害する可能性があります。ミックスの感度を考慮して、大幅な遅延が見られる場合は、qPCR 反応で使用する前にサンプルを希釈することをお勧めします。

異なる粗サンプルでは異なるレベルの阻害が観察されるのが通常ですか？

はい、これは予想通りです。粗生物学的サンプル、特に唾液には、さまざまなレベルの PCR 阻害物質が含まれています。唾液サンプルが異なると、同じターゲットの増幅に 0.5 ～ 3.5 サイクルの遅延が生じることが確認されています。同じ粗生物学的サンプルでも、時間の経過とともに阻害レベルが異なる場合があります。

このミックスはどのような阻害剤を許容しますか？

弊社の阻害剤耐性ミックスはすべて、粗唾液および粗血液でテストされ、耐性があります。さらに、臨床、植物、環境、および実験室の化学物質に含まれる複数の PCR 阻害剤の存在下で広範囲にテストされています。これらには、ヘミン、ヘモグロビン、ヘパリン、ラクトフェリン、IgG 免疫グロブリン、グアニジン、SDS、エタノール、尿素、クエン酸ナトリウム、フミン酸、セルロース、ペクチン、ケルセチン、カテキン、タンニン酸、およびクロロフィル B が含まれます。耐性の程度は化合物によって異なります。ここに記載されていない、またはまだテストされていない他の化合物にも耐性がある場合があります。