for high resolution melt (HRM) curve analyses

Clara®HRM Mix

この qPCR ミックスは、高解像度融解曲線 (HRM) 分析に最大限の特異性をもたらします。遺伝子変異を正確に検出し、SNP に基づいて遺伝子型を迅速に識別し、HRM 分析でターゲット領域のメチル化率を計算します。

Clara® HRM Mix は、dNTP と MgCl2 を含むブレンドに、PCR BioSystems 社独自の超純粋な PCRBIO Taq DNA ポリメラーゼが含まれています。PCR 阻害を大幅に軽減する当社の第 3 世代の DNA インターカレーション SyGreen 2 色素を利用したこの新世代の高分解能溶融 qPCR マスターミックスは、正確な SNP 識別とメチル化の違いの定量化に優れたパフォーマンスを提供します。

特長

  • SNPクラス I – IV の正確な区別
  • ターゲット配列のメチル化を定量
  • 個別の対立遺伝子プロファイルを検出するための超高感度の融解曲線
  • すべてのHRM対応リアルタイム機器と互換性あり
  • PCRBIO Taq DNA ポリメラーゼを搭載

アプリケーション

  • SNP 遺伝子型解析
  • 遺伝子検査
  • CpGメチル化解析

アプリケーションノート

HRMとは？

高解像度融解曲線 (High Resolution Melt) 分析は、二本鎖 DNA サンプルの変異、多型、エピジェネティックな差異の分析に使用される強力な手法です。この方法は、qPCR ターゲットの増幅後の変性と、ポリメラーゼ阻害を低減した第 3 世代 DNA インターカレーション色素 (SYBR Green 2、EvaGreen など) を組み合わせて分析します。HRM 分析では、融解曲線の形状と DNA 融解温度の違いを利用して、サンプル間の配列の変異を区別します。

通常、標準的な色素ベースの qPCR の後に実行される融解曲線分析では、蛍光データは 0.2 ～ 0.5 °C ごとに取得されますが、HRM 分析ではデータが 0.1 °C ごとにはるかに高い密度で取得されるため、得られる融解曲線の解像度がはるかに高くなります。これによりターゲット シーケンスの小さな違い (単一点変異、SNP、および塩基対メチル化まで) も、シフトした融解曲線として記録されます。したがって、HRM は、SNP 検出、対立遺伝子識別、またはターゲット バリアント検出のためのプローブベースの検出に代わる、より安価で効果的な代替手段を提供します。

SNPの検出

独自のスマート スクリーン技術により、優れた SNP 識別機能を保証する新しい組成の酵素バッファーの開発が可能になりました。Clara® HRM Mix を使用して、すべてのクラスの SNP を識別します。

  • Class IV: A to T
  • Class I: C to T and G to A
  • Class II: C to A and G to T
  • Class III: C to G

上図：Clara® HRM Mixを使用した4つのSNPの高解像度融解解析
A. OCA2 遺伝子の発現に関連する SNP rs12913832 (G/A)、B. C3 遺伝子の発現に関連する SNP rs2230199 (C/G)、C. DPYD 遺伝子の発現に関連する SNP rs641805 (A/T)、D. TP53 遺伝子の発現に関連する SNP rs9903378 (A/C)。反応には、各プライマー 0.4 μM とヒトゲノム DNA 5 ng が含まれます。サイクル条件は、95°C 2 分、続いて 95 °C 5 秒と 60 °C 20 秒の 45 サイクルでした。

Clara® HRM Mix では、超高感度の融解曲線分離により、クラス I からクラス IV の SNP を正確に区別できます。

メチル化分析

Clara® HRM Mix は、HRM qPCR と亜硫酸水素塩シーケンシングを組み合わせることで、ターゲット シーケンスの CpG メチル化を定量化するためにも使用できます。
亜硫酸水素塩処理済みサンプルと、対応する未処理のコントロール サンプルを比較した HRM 分析により、ターゲットのシトシン メチル化率を推定できます。これは、亜硫酸水素塩処理後のメチル化シーケンスは、メチル化されていないターゲットと比較して CG 含有量が高くなるためです。

上図：HRM法によるFN3K遺伝子のDNAメチル化解析
異なるレベルのメチル化 (0%-100%) を持つヒトゲノム DNA は、qPCR 増幅の前に亜硫酸水素塩で処理されました。qPCR 反応には、各プライマー 0.4 μM とヒトゲノム DNA 5 ng を含む Clara® HRM Mix を使用しました。サイクル条件は、Roche Applied Science Lightcycler® 96 で、95°C 2 分、続いて 95 °C 15 秒、60 °C 20 秒、72 °C 10 秒の 45 サイクルでした。

Clara® HRM Mix を使用すると、DNA ターゲットの CpG メチル化を正確に推定できます。

参考データ：SNP rs12913832 のHRM分析

SNP rs12913832 のHRM分析: A. Clara HRM ミックス、B. PCRBIO Sygreen ミックス、C. Thermo MeltDoctor HRM マスター ミックス、D. Bio-Rad Precision Melt スーパーミックス、E. Kapa HRM Fast qPCR キット、F. BioGire Defense LightScanner マスター ミックス、G. Qiagen Type-it HRM PCR キット、H. Roche LightCycler 480 高解像度融解マスター ミックス。Clara HRM ミックス反応には、各プライマー 0.4 µM とヒトゲノム DNA 5 ng が含まれます。サイクル条件は、96℃ 2 分、続いて 95℃ 5 秒、60℃ 20 秒の 45 サイクルでした。その他はすべて製造元の指示に従います。

測定可能な機器の例

HRM 実験を実行するには、互換性のある機器が必要です。すべてのリアルタイム PCR 機器が HRM プロファイリングを実行するために必要な温度増加を実現できるわけではありません。次のメーカーの qPCR サーマルサイクラーのいずれかを使用することをお勧めします。

※ 2024年12月現在

  • Applied Biosystems: 7900, 7900HT, 7900HT FAST, StepOne, StepOne Plus, 7500, 7500 FAST, Viia7
  • Bio-Rad: CFX96, CFX384
  • BMS: Mic
  • Eppendorf: Mastercycler ep realplex, Mastercycler realplex 2S
  • Illumina: Eco
  • Qiagen/Corbett: 6000, Q
  • Roche Applied Science: Lightcycler 480, Lightcycler Nano

製品仕様

Clara® HRM Mix

Component100 reactions500 reactions2000 reactions
2x Clara HRM Mix1 x 1 mL5 x 1 mL20 x 1 mL
Reaction VolumeStorage
20 μL到着後、製品は -30 °C ～ -20 °C で保管する必要があります。正しく保管すれば、キットは指定された有効期限まで完全な活性を維持します。
Instrument Compatibility
この製品は、すべての標準および高速サイクリング qPCR 機器と互換性があります。qPCR 選択ツールを使用して、どの ROX バリアントがお使いの機器と互換性があるかを確認してください。

FAQs

Clara® HRM Mix でマルチプレックス化は可能ですか？
HRM 分析で非特異的な生成物を除去するにはどうすればよいでしょうか？
Clara® HRM Mix で高品質の結果を達成するための一般的な考慮事項は何ですか？
Clara® HRM Mix には何が含まれていますか？
アンプリコンの長さはどのくらいにすべきでしょうか？
Clara® HRM Mix はどの機器と互換性がありますか？
Clara® HRM Mix を競合他社のミックスと比較すると、満足のいく結果が得られない、または異なる結果が観察されるのはなぜですか？
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