Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe Mixes および Probe 1-Step Mixes は、プローブベースの qPCR および 1 ステップ RT-qPCR 用の、簡単に乾燥可能な広域スペクトル阻害剤耐性 4x ミックスです。

PCR と qPCR は、さまざまな化合物によって阻害される可能性があります。このような阻害剤は、qPCR ワークフローや診断プロセスに悪影響を与える可能性があります。風乾可能な阻害剤耐性プローブ ミックスは、Hot start Taq DNA polymerase (1 ステップ ミックスの場合は RTase および RNase 阻害剤)、緩衝剤、マグネシウム、dNTP、賦形剤のブレンドを含む 4x レディ ミックスで、活性を失わずに確実に風乾できるため、シングル チューブ フォーマットでプローブベースの qPCR を確実に成功させることができます。エンド ユーザーは、これらのミックスをプライマー、プローブ、テンプレートと組み合わせて、単一または多重検出を行うことができます。これらのミックスは、TaqMan、Scorpions、分子ビーコンなどのすべてのプローブ化学と普遍的に互換性があり、すべての市販のリアルタイム PCR 機器と最大限の互換性があります。

さらに、両方のミックスは空気乾燥可能（グリセロールフリー）であるため、標準的な実験室用オーブンで乾燥させて、活性を失わずに室温で長期保存することができます。迅速な空気乾燥用に設計された Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe (1-Step) Mixes は、体外診断キット開発 (IVD) での使用を目的としていますが、乾燥 (RT-) qPCR 反応の利点を享受したいと考える人にも使用できます。空気乾燥プロトコルに必要な時間と専門知識は、フリーズドライ (凍結乾燥) に比べて大幅に少なく、非常に簡単な装置です。5 μL の 4x Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe (1-Step) Mixes (最終反応量 20 μL に必要) は、標準的な実験室用オーブンを使用して、わずか 80 ～ 90 分で乾燥してゲルにすることができます。

プローブ ミックスは DNA テンプレートの増幅に適しています。ワンステップミックスは、テンプレートの種類に関係なく、効率を損なうことなく DNA サンプルと RNA サンプルの両方を増幅するために使用できます。

プローブとプローブ 1 ステップ qPCR ミックスは、広範な一般的な PCR 阻害剤に対してテスト済みであり、耐性があります。これには、標準的な実験室化学物質 (SDS、グアニジン、エタノール) や、血液サンプル (ヘミン、ヘマチン、ヘモグロビン、ヘパリン、IgG 免疫グロブリン、ラクトフェリン、クエン酸ナトリウム)、唾液、尿 (尿素)、植物、環境サンプル (フミン酸、カテキン、ケルセチン、タンニン酸、セルロース、クロロフィル) に含まれる生物学的サンプル阻害剤などが含まれますが、これらに限定されません。この混合物は、他の複数の純粋な化学阻害剤とともに、粗製 (または希釈された) 唾液および血液に対して広範囲に検証されています。

• 反応混合物の体積と質量が削減されるため、輸送と保管のコストが安くなります
• 空気乾燥した最終ゲルは室温で安定しているため、コールドチェーン輸送や保管の必要がなくなります。これにより物流が簡素化され、全体的なコストが削減されます
• 使用できるサンプル量を増やすことができます。サンプル投入量は最終反応量と等しくなります。これは、ターゲットコピー数が少ない希釈サンプルに最適です。
• オーブンでの自然乾燥は、専門的な機器や知識を必要としないため、非常に利用しやすい方法であり、追加のスタッフやプロジェクトの外注の必要がありません。
• 中小規模の IVD キット開発者向けの乾燥プロセスと最終製品開発の制御の向上

3 つの RNA ターゲット、B2M (β-マイクロチューブリン)、γ-アクチン、および GAPDH を、Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mixes を使用したシングルプレックス RT-qPCR 反応で増幅しました。ミックスは乾燥され、-20 °C で保存されました (青い曲線)。または 37 °C で 12 週間インキュベートされました (紫色の曲線)。乾燥前後の反応効率を各グラフの差し込み図として示します。マウス RNA の 1.25 ng/μL、125 pg/μL、12.5 pg/μL、および 1.25 pg/μL の 4 つの段階希釈を使用しました。サイクル条件は、45 °C で 20 分間、95 °C で 2 分間、その後 95 °C で 10 秒、60 °C で 30 秒を 54 サイクルでした。

4 つの RNA ターゲット、SARS-CoV-2 E 遺伝子 (E 遺伝子)、呼吸器合胞体ウイルス (RSV)、インフルエンザ A (INF-A)、インフルエンザ B (INF-B) が、乾燥および再構成後の Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mix または Meridian Air-Dryable Direct RNA/DNA qPCR Saliva を使用したマルチプレックス 1 ステップ RT-qPCR 反応で、ヒト唾液あり (下段) およびなし (上段) で増幅されました。各ターゲットについて 3 つの技術的複製を含む 4 つのテンプレート希釈 (4000、400、40、および 4 コピー) を 20 μL 反応で使用しました。唾液を使用した反応には、汎用輸送培地で 1/10 に希釈された 5 μL の唾液が含まれ、これは反応あたり 2.5% のヒト唾液に相当します。Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mix は、唾液がない場合には Meridian Air-Dryable Direct RNA/DNA qPCR Saliva と同等であり、2.5% のヒト唾液がある場合には Meridian を大幅に上回ります。

サル痘 MPX ウイルスの異なる株に対応する 3 つの DNA ターゲット。GEN (一般的な MPX 株)、CB (コンゴ盆地変異体)、WA (西アフリカ変異体) は、Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mix または Meridian Air-Dryable Direct RNA/DNA qPCR Saliva (乾燥前) を使用して、ヒト唾液存在下で増幅されました。各ターゲットに対して 3 つの技術的複製を含む 4 つのテンプレート希釈度 (10,000、1,000、100、および 10 ウイルス DNA コピー) が、20 µL 反応で使用されました。唾液を使用した反応には、汎用輸送培地で 1/10 に希釈された 5 µL の唾液が含まれ、これは反応あたり 2.5% のヒト唾液に相当します。サイクル条件は、95℃で3分、続いて95℃で10秒、60℃で20秒を50サイクルでした。Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mix は、2.5%のヒト唾液が存在するMeridian Air-Dryable Direct RNA/DNA qPCR Saliva と一致します。

4 つの RNA ターゲット、SARS-CoV-2 E 遺伝子 (E 遺伝子)、呼吸器合胞体ウイルス (RSV)、インフルエンザ A (INF-A)、インフルエンザ B (INF-B) を、乾燥前 (青い曲線) と乾燥後 (40 °C で 80 分) (紫色の曲線) の Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mix を使用したマルチプレックス 1 ステップ RT-qPCR 反応で、ヒト唾液を用いて増幅しました。各ターゲットに対して 3 つの技術的複製を含む 4 つのテンプレート希釈度 (4000、400、40、および 4 コピー) が 20 μL 反応で使用されました。汎用輸送培地で 1/10 に希釈した唾液 5 μL (2.5% のヒト唾液に相当) が反応ごとに追加されました。サイクル条件は、47 °C で 10 分間、95 °C で 2 分間、続いて 95 °C で 10 秒間、60 °C で 30 秒間を 50 サイクルでした。

Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe Mix

Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mix

乾燥条件を変えることはできますか？

製品マニュアルに記載されている乾燥条件は、当社のラボでテストされたサイクルの一例にすぎません。空気乾燥の場合、重量損失 (乾燥減量、LoD) が約 70 ～ 75 % になることが重要です。これにより、乾燥ゲルに含まれる水分が 5 ～ 10 % のみになります。

乾燥時間は使用する器具によって異なります。特定のオーブンで初めてこの製品を使用する場合は、複数のチューブを使用して定期的に (60、70、80、90 分後など) LoD を測定し、最適なプロトコルを定義し、混合物 (オリゴの有無にかかわらず) および使用する乾燥機器に基づいて 74.5 ± 10.5 % または 70 ± 1 % の LoD を達成することをお勧めします。

温度を変更することもできますが、当然ながら温度が低いほど時間がかかり、温度が高いと混合成分の完全性に影響を与えるリスクがあるため、予期しない問題が発生する可能性を最小限に抑えるために 40 °C を使用することをお勧めします。

このミックスで高速サイクリングを実施できますか？

1 秒の変性と 3 秒のアニーリングと伸長を含む 40 サイクル (2 ステップ サイクル) を使用して、さまざまなターゲットに対する信頼性の高い増幅が達成されています。このような条件下で増幅を成功させるには、適度に短いアンプリコンが必要であり、実験に追加されるすべての新しいターゲットについてケースバイケースでテストする必要があります。

このミックスを凍結乾燥してもよいでしょうか？

このミックスは凍結乾燥に成功しましたが、凍結乾燥はお勧めしません。賦形剤の含有量は空気乾燥用に最適化されているため、製品の凍結乾燥の安定性が大幅に低下します。このミックスは空気乾燥のみに使用することをお勧めし、凍結乾燥プロトコルには当社の Lyo-Ready 製品シリーズをお勧めします。

このミックスに植物の粗抽出物を使用できますか？

結果は植物種や組織の種類によって異なります。当社の阻害剤耐性化学物質は、クロロフィルやカテキン、ケルセチンなどのポリフェノールに対して中程度の耐性を示しますが、タンニン酸、セルロース、ペクチンに対しては低い耐性を示します。したがって、希望するサンプルの種類でミックスをテストすることをお勧めします。すべての植物組織は、阻害剤耐性混合物を使用する前に、適切な抽出バッファーで機械的に溶解して細胞壁と膜を破壊する必要があります。対象サンプルの種類で少数の反応をテストすることをお勧めします。製品サンプルをリクエストする場合、またはこのようなテスト反応の計画にサポートが必要な場合はお問い合わせください。

このミックスを使用する前に唾液サンプルを前処理する必要がありますか？

唾液サンプルは前処理を必要としません。ただし、適切なサンプル輸送培地で希釈することをお勧めします。グアニジン塩化物を含まない UTM の使用を強くお勧めします。

1 回の反応あたりどのくらいの量の粗血液を追加できますか？

弊社では、20 μL 反応あたり最大 5 μL の血液サンプル (NaCl/EDTA 溶液で 1:4 に希釈した粗血液 1.25 μL) でマルチプレックス反応を実行することに成功しました。これにより全体的な蛍光は減少しますが、qPCR 反応自体が阻害されることはなく、みっくづの感度も制限されませんでした。

1 回の反応あたりどのくらいの量の粗唾液を追加できますか？

1回の反応につき最大10%の粗唾液のテストに成功しており、2.5%の唾液を使用した場合に最も良い一貫した結果が得られました。

粗サンプルが存在する場合、Cq に多少の遅延が見られるのは正常ですか？

はい。ミックスは阻害剤耐性がありますが、阻害剤の存在に対して完全に耐性があるわけではありません。異なる阻害剤や高濃度でも qPCR 反応を阻害する可能性があります。ミックスの感度を考慮して、大幅な遅延が見られる場合は、qPCR 反応で使用する前にサンプルを希釈することをお勧めします。

粗サンプルが異なると阻害レベルが異なるのは正常ですか？

はい、これは予想通りです。粗生体サンプル、特に唾液には、さまざまなレベルの PCR 阻害物質が含まれています。唾液サンプルが異なると、同じターゲットの増幅に 0.5 ～ 3.5 サイクルの遅延が生じることが確認されています。同じ粗生体サンプルでも、時間の経過とともに阻害レベルが異なる場合があります。

このミックスはどのような阻害剤に耐性がありますか？

弊社の阻害剤耐性ミックスはすべて、粗唾液および粗血液でテストされ、耐性があります。さらに、臨床、植物、環境、および実験室の化学物質に含まれる複数の PCR 阻害剤の存在下で広範囲にテストされています。これらには、ヘミン、ヘモグロビン、ヘパリン、ラクトフェリン、IgG 免疫グロブリン、グアニジン、SDS、エタノール、尿素、クエン酸ナトリウム、フミン酸、セルロース、ペクチン、ケルセチン、カテキン、タンニン酸、およびクロロフィル B が含まれます。耐性の程度は化合物によって異なります。ミックスは、記載されていない、またはまだテストされていない他の化合物にも耐性がある場合があります。

より多くの量を乾燥させたい場合はどうすればよいですか？

マニュアルに記載されている指示に従って、1 ウェルあたり 5 ～ 6 μL を超える混合物 (およびオリゴ) を乾燥させることはお勧めしません。製造のスループットを高めるために、複数のプレートを同時に乾燥させることができます。大量の空気乾燥はお勧めしません。Lyo-Ready 製品シリーズを使用して凍結乾燥することをお勧めします。