Constantine Garagounis, PhD

空気乾燥は、乾燥形式の qPCR ベースの診断キットを開発するためのシンプルで高速、かつコスト効率の高いオプションとして登場しました。PCR Biosystems 社の新しい Air-Dryable Inhibitor-Tolerant qPCR mixes により、キット開発者は、最も困難なサンプル タイプでも高感度検出が可能な室温で安定した分子検査を自信を持って作成できるようになりました。

Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe Mix と Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mix で開発された qPCR および RT-qPCR アッセイは、シンプルな実験室用オーブンを使用して、大規模なトレーニングを必要とせずに、わずか 80 ～ 90 分で社内で乾燥できます。組織は、インフラやアウトソーシングに多大なコストを費やすことなく、乾燥プロセスと品質管理ステップを完全に制御できます。

目的の用途に適したプライマーとプローブの濃度が特定されると、これらの空気乾燥可能なミックスは、反応チューブまたは 96 ウェル プレート内で直接乾燥できます。この乾燥ミックスは、室温で少なくとも 12 か月間保存できるため、コールド チェーン輸送と保管のコストとロジスティクスが不要になります。乾燥した反応ミックスは、サンプルと PCR グレードの水をチューブに加えるだけで再構成できます。通常のウェット ミックスと同様に、単純な再懸濁の後、標準的な qPCR または RT-qPCR サーマルサイクリング プログラムを実行できます。

最適なサンプル抽出技術により、多くの場合、qPCR ワークフローや診断プロセスにおける阻害の問題を軽減できます。ただし、血液、組織、細胞破片を含むサンプルなど、特定の種類のサンプルでは、阻害性化合物が原因で継続的な課題が生じます。さらに、唾液や尿などの粗サンプルで PCR を実施する傾向が高まっていますが、これらのサンプルには PCR 阻害物質が本質的に豊富に含まれています。

この課題に対処するため、広範囲の化合物に対する耐性を強化した Air-Dryable Inhibitor-Tolerant mixes が開発されました。これには、SDS、グアニジン、エタノールなどの一般的な実験室用化学物質や、血液、唾液、尿に含まれる生物学的サンプル阻害剤が含まれます。このミックスは、ヘミン、ヘマチン、ヘモグロビン、ヘパリン、免疫グロブリン、ラクトフェリン、クエン酸ナトリウム、尿素、フミン酸、カテキン、ケルセチン、タンニン酸、セルロース、クロロフィルなどの阻害剤が存在する状況でも、堅牢なパフォーマンスを発揮することが実証されています。

Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mix は、RNA (および DNA) 配列を高感度に検出するための多用途のオールインワン 4x ミックスとして設計されています。これには活性を失わずに確実に乾燥できるよう最適化された賦形剤のブレンドが含まれており、上記に列挙した他の純粋な化学阻害剤とともに、粗製（または希釈）唾液および血液に対して広範囲に検証されています。

Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mix は主に診断用途向けに設計されているため、2.5% の粗唾液の存在下で 4 つの一般的な冬季ウイルスに対するマルチプレックス アッセイでその性能をテストしました。冬季呼吸器疾患テスト パネルの代表として、インフルエンザ A、インフルエンザ B、RS ウイルス、および SARS-CoV-2 を RNA ターゲットとして選択しました。4000 から 4 コピーまでの希釈液をテンプレートとして使用し、乾燥によってミックスの性能が影響を受けるかどうかをテストするために、湿った状態と再構成した状態 (乾燥後) の両方の Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mix を使用してアッセイを設定しました。

結果 (図 1) は、このミックスが、テストしたすべての標的分子の少なくとも 4 コピーまでを確実に検出できること、乾燥後のミックスの性能に重大な影響がないこと、およびミックスが唾液に強い耐性を示すことを示しています。

一般的な哺乳類のハウスキーピング遺伝子である B2M、γ-アクチンおよび GAPDH を検出するためのシングルプレックス反応を使用して、乾燥ミックスの安定性もテストしました。アッセイは、-20 °C で 12 週間保存した乾燥ミックスを含む反応チューブと、同じ期間 37 °C で保存した同量の乾燥ミックスを含む反応チューブに、同じ濃度の RNA サンプルを添加することによって設定されました。

この実験の結果 (図 2) は、37 °C で少なくとも 12 週間保存した後でもパフォーマンスへの影響が最小限であることを示しており、Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mix の極めて優秀な堅牢性が実証されています。

阻害剤に対する耐性が優れているアッセイにより、診断精度が向上し、抽出手順が減り、結果が早く得られ、最終的にはテストコストが削減されます。PCR Biosystems 社のAir-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mix はこのニーズを満たすように設計されています。正確な qPCR と広範囲の阻害剤耐性を組み合わせ、キットメーカーが乾燥アッセイ形式を開発するためのシンプルで低コストな方法を提供します。

これらの強力な酵素ミックスは、テストされた条件下では、唾液の存在下または空気乾燥の結果として、パフォーマンスまたは活性の損失に重大な影響を与えません。さらに、乾燥したミックスは、空気乾燥後、最低 12 週間は 37 °C で安定しています。最も困難なサンプルのポイントオブケア検出用の室温で安定した qPCR アッセイが、これまで以上に利用しやすくなりました。

PCR Biosytems 社の空気乾燥可能および凍結乾燥可能な試薬について詳しく知りたい場合、またはお客様のアプリケーションに最適な製品についてご相談したい場合は、お問い合わせください。

この製品は ISO 13485 認定の品質管理システムの下で製造されており、分子生物学診断用のコンポーネントとしてのさらなる製造用途に適しています。PCR Biosystems 社の製品は、最適なパフォーマンス、一貫性、トレーサビリティを確保するために、ISO 13485 規格に従って広範囲にテストされ、包括的な多段階の品質管理プロセスを経ています。